O-Glykosylierung bei Saccharomyces cerevisiae: Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung der PMT-Genfamilie
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
18
2.1
MATERIAL
18
2.1.1
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
OLIGONUKLEOTIDE UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
18
2.1.2
GERAETE
19
2.1.3
MEDIEN
19
2.1.3.1
HEFEMEDIEN
19
2.1.3.2
ESCHERICHIA
COLI
MEDIEN
20
2.1.4
VERWENDETE
ORGANISMEN
20
2.1.4.1
VERWENDETE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE-STAEMME
20
2.1.4.2
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
21
2.1.5
VERWENDETE
PLASMIDE
UND
GENBANK
21
2.1.6
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
22
2.2
METHODEN
23
2.2.1
ANZUCHTBEDINGUNGEN
23
2.2.2
REINIGUNGEN
UND
EXTRAKTIONEN
23
2.2.2.1
REINIGUNG
DER
CHITINASE
23
2.2.2.2
ZELLFRAKTIONIERUNG
24
2.2.3
ENZYMTEST
DER
DOL-P-D-MAN:PROTEIN
O-D-MANNOSYLTRANSFERASE
1
(PMTLP)
24
2.2.4
HERSTELLUNG
VON
DOI-P-[
14
C]
MANNOSE
24
2.2.5
HPLC
(HIGH
PRESSURE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
RP
18
(REVERSED PHASE)
25
2.2.6
[
35
S]
IN
VIVO
MARKIERUNG
VON
HEFEZELLEN
25
2.2.7
FREMDEXPRESSION
VON
PMTLP
IN
E.
COLI
25
2.2.8
SPALTUNG
MIT
ENDOGLYKOSIDASE
F
(ENDO
F)
26
2.2.9
GELELEKTROPHORESEN
26
2.2.9.1
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE)
26
2.2.9.2
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
27
2.2.10
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
27
2.2.10.1
IMMUNISIERUNG EINES
KANINCHENS
27
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.10.2
GEWINNUNG
DES
ANTISERUM
27
2.2.10.3
WESTEM-BLOT-ANALYSE
27
2.2.11
NUKLEINSAEUREPRAEPARATIONEN
28
2.2.11.1
PRAEPARATIONEN
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
(=
MINI-PRAEP)
28
2.2.11.2
PRAEPARATION GROESSERER
PLASMIDMENGEN
AUS
E.
COLI
(=
MIDI-PRAEP)
28
2.2.11.3
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
HEFE
28
2.2.11.4 PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFE
28
2.2.11.4.1
MOERSER-METHODE
ZUR
RNA-ISOLIERUNG
28
2.2.11.4.2
HOT-PHENOL-METHODE
ZUR
RNA-ISOLIERUNG
29
2.2.11.5
NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
29
2.2.12
KLONIERUNGSTECHNIKEN
30
2.2.12.1
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
30
2.2.12.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-AGAROSEGELEN
30
2.2.13
PCR
(POLYMERASE CHAIN
REACTION)
30
2.2.14
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
UND TRANSFORMATIONEN
30
2.2.14.1
E.
COLI
30
2.2.14.2
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
31
2.2.15
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
31
2.2.15.1
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
31
2.2.15.2
REINIGUNG
DER
MARKIERTEN
DNA-SONDE
31
2.2.15.3
HYBRIDISIERUNG
31
2.2.15.4 DETEKTION
DER
HYBRIDISIERTEN
DNA
32
2.2.15.5
SOUTHERN-BLOT
ANALYSEN
VON
DNA
32
2.2.15.6
NORTHEM-BLOT
ANALYSEN
VON
RNA
32
2.2.15.7
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
32
2.2.15.8
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
VON
PMT3
33
2.2.16
SEQUENZANALYSEN
UND
DATENVERARBEITUNG
33
2.2.16.1
DNA-SEQUENZANALYSE
33
2.2.16.2 DATENVERARBEITUNG
UND
COMPUTERANALYSE
VON
DNA
UND
PROTEINSEQUENZEN
33
2.2.17
ETHYLMETHANSULFONAT
(EMS)
UND
N-METHYL-N
'
-NITRO-N
'
-NITROSOGUANIDIN
(MNNG)
MUTAGENESE
33
INHALTSVERZEICHNIS
3
ERGEBNISSE
35
3.1
AUSGANGSSITUATION
35
3.2
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
TEILEN
DES
PMTL-GENS
35
3.2.1
SUCHE
EINES
C-TERMINAL
VERLAENGERTEN KLONS
35
3.2.2
SEQUENZIERUNG
DES
PMTL-GENS
MIT
HILFE SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
37
3.2.3
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
PMT1
38
3.3
IN
VITRO
AKTIVITAET
DES
MIT ENDO
F
DEGLYKOSYLIERTEM
PMTLP
40
3.4
FREMDEXPRESSION
VON
PMTLP
IN
E.
COLI
41
3.5
SUCHE
NACH
EINER
WEITEREN
DOL-P-D-MAN:PROTEIN
O-D-MANNOSYLTRANSFERASE
47
3.5.1
DURCHSUCHEN
EINER
PCS19-GENBANK
UNTER
WENIGER
STRINGENTEN
BEDINGUNGEN
47
3.5.2
VERSUCH
DER
KOMPLEMENTATION
VON
O-GLYKOSYLIERUNGSMUTANTEN
47
3.6
SUCHE
NACH
WEITEREN
MITGLIEDERN
DER
PA/T-GENFAMILIE
50
3.6.1
PCR
MIT
DEGENERIERTEN
PRIMERN
50
3.6.2
SUBKLONIEREN
DER
PCR-FRAGMENTE
IN
DEN
PUC19-VEKTOR
51
3.6.3
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
MIT
DEN
AUS
DER
PCR
ERHALTENEN
FRAGMENTEN
52
3.6.3.1
PMT3
52
3.6.3.2
PMT4
53
3.7
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
PMT3
UND
PMT4
54
3.7.1
PMT3
54
3.7.2
PMT4
55
3.8
DIE
AMINOSAEURE
UND
NUKLEOTIDSEQUENZ
VON
PMT3
UND
PMT4
56
3.8.1
PMT3
56
3.8.2
PMT4
58
3.9
KONSTRUKTION
DER
DISRUPTIONSPLASMIDE
65
3.9.1
PMT3:
INSERTION
DES
HIS3-GENS
65
3.9.2
PMT4'.
INSERTION
DES
TRPI-GENS
66
3.10NORTHEM-BLOT-ANLALYSE
68
3.11
CHROMOSOMENLOKALISATION
68
3.11.1
PMT3
68
3.11.2
PMT4
69
3.12
GEWINNUNG
EINES
ANTIKOERPERS
GEGEN
DIE
DEGLYKOSYLIERTE
CHITINASE
69
3.12.1
DEGLYKOSYLIERUNG
DER
CHITINASE
69
3.12.2
PRODUKTION
UND
TESTEN
EINES
ANTISERUMS GEGEN
DIE DEGLYKOSYLIERTE
CHITINASE
70
INHALTSVERZEICHNIS
3.12.3
AUSTESTEN
DES
ANTIKOERPERS
IN
DEN
PZN/7-EINFACH
UND
PMR//^M/2-DOPPELDISRUPTANTEN
71
3.13
FUNKTION
DER
GENPRODUKTE
73
3.13.1
FUNKTION
DES
PAZTW-GENPRODUKTS
73
3.13.2
FUNKTION
DES
PA/73-GENPRODUKTS
73
4
DISKUSSION
75
5
ZUSAMMENFASSUNG
82
6
LITERATURVERZEICHNIS
83 |
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