Funktion kleiner G-Proteine in Grünalgen: Charakterisierung und Lokalisierung von fünf Ypt-Proteinen in Volvox-carteri- und Chlamydomonas-reinhardtii-Zellen
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
IV
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
.
10
2.1.
ORGANISMEN
UND
VEKTOREN
.
10
2.2.
HERKUNFT
VON
CHEMIKALIEN
UND
ENZYMEN
.
10
2.3.
VERWENDETE
OIIGONUKLEOTIDE
.
12
2.4.
NAEHRMEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
.
12
2.5.
PUFFER
.
14
3.
METHODEN
.
20
3.1.
KULTUREN
.
20
3.1.1.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
E.
COLI
.
20
3.1.2.
KULTURHALTUNG
VON
V.
CARTERI
.
20
3.1.3.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
CHLAMYDOMONAS
.
20
3.2.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
20
3.2.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
20
3.2.2.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
C.
REINHARDTII
.
21
3.2.3.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
DURCH
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
21
3.2.4.
AUFTRENNUNG
VON
RNA
DURCH
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
22
3.2.5.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
UND
REINIGUNG
VON
.
22
PCR-PRODUKTEN
MITTELS
GENE-CLEAN
.
22
3.2.6.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
22
3.2.7.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
23
3.3.
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
.
23
3.3.1.
SPALTEN
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENZYME
.
23
3.3.2.
BEHANDLUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
KLENOW-POLYMERASE
.
23
3.3.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
23
3.3.4.
LIGIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
VEKTOR-DNA
.
24
3.4.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
PLASMID-DNA
.
24
3.5.
DNA-SEQUENZANALYSE
.
24
3.5.1.
SEQUENZIER-REAKTION
.
24
3.5.2.
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
.
25
3.6.
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
25
3.6.1.
UEBERTRAGUNG
VON
RNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
.
25
NYLON-FILTER
(NORTHERN
BLOT)
.
25
3.6.2.
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
.
25
3.6.3.
PRAEHYBRIDISIERUNG,
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
.
26
DURCH
AUTORADIOGRAPHIE
.
26
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.7.
HETEROLOGE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
V.
CARTERI-YPT-PROTEINE
(REYPT)
IN
E.
COLI
.
26
3.7.1.
DAS
PET-19B/E.
COLI BL21(DE3)-EXPRESSIONSSYSTEM
.
26
3.7.2.
ANZUCHT
DER
ZELLEN
UND
INDUKTION
DER
REYPTV-EXPRESSION
.
27
3.8.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
28
3.8.1.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
V.
CARTERI
YPT-PROTEINE
.
28
3.8.2.
GEWINNUNG
VON
GESAMTPROTEINEXTRAKTEN
AUS
V.
CATERI
-
.
28
UND
C.
REINHARDTII-ZEUEEN
.
28
3.8.3.
GEWINNUNG
VON
GEISSELEXTRAKTEN
AUS
V.
CATERI
.
29
UND
C.
REINHARDTII-ZEWEA
.
29
3.8.4.
GEWINNUNG
VON
MEMBRAN
UND
CYTOPLASMAEXTRAKTEN
AUS
V.
CARTERI.
29
3.8.5.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
30
3.8.6.
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
30
3.8.7.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
.
30
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
30
3.8.8.
ANFAERBEN
VON
SDS-GELEN
DURCH
COOMASSIE-BLAU
.
30
3.8.9.
ANFAERBEN
VON
SDS-GELEN
DURCH
SILBERFAERBUNG
.
31
3.8.10.
TRANSFER
AUF
GETRENNTER
PROTEINE
AUF
NITROZELLULOSE-FILTER
.
31
(WESTERN
BLOT)
.
31
3.8.11.
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
.
CHEMILUMINESZENZ
.
31
3.9.
PRODUKTION
VON
AYPTV-ANTIKOERPERN
.
31
3.9.1.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
.
31
3.9.2.
GEWINNUNG
DER
AYPTV-SEREN
.
32
3.9.3.
REINIGUNG
DER
ROHSEREN
DURCH
PRAEADSORPTION
(DEPLETION)
.
32
UND
ANTIGENAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
32
3.9.3.1.
AUSGANGSMATERIAL:
HERSTELLUNG
VON
ANTIGEN
.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE-SAEULEN
UND
E.
COLI
ROHLYSATEN
AUS
REYPTV-UEBEREXPRESSIONSKULTUREN
32
3.9.3.2.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
.
AYPTV
ROHSEREN
.
32
3.10.
IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE
.
33
3.11.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
33
3.11.1.
FIXIERUNG
UND
EINBETTUNG
VON
V.CATERI
UND
C.
REINHARDTII
ZELLEN
FUER
IMMUNGOLD-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
33
3.11.2.
IMMUNGOLD-MARKIERUNG
VON
ULTRADUNNSCHNITTEN
.
34
3.11.3.
OSO4-FIXIERUNG
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
.
34
FUER
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
34
4.
ERGEBNISSE.
36
4.1.
GEWINNUNG
SPEZIFISCHER
ANTI-YPTV
ANTIKOERPER
.
36
4.1.1.
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSPLASMIDEN
ZUR
HETEROLOGEN
.
36
EXPRESSION
DER
V.
CARTERI
-YPT-GENE
IN
E.
COLI
.
36
4.1.2.
EXPRESSION
VON
V.
CARTERI
-YPT-GENEN
IN
E.
COLI
.
39
4.1.3.
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
V.
CARTERI-YPT-PROTEINE
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
40
4.1.4.
SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
ANTI-YPTV
ANTIKOERPER
.
41
4.2.
YPTV-GENEXPRESSION
IN
V.
CARTERI-ZELLEN
.
42
4.2.1.
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
YPTV-PROTEINE
IN
GESAMTZELLEXTRAKTEN
VON
V.
CORTERI-SOMAZELLEN
UND
GONIDIEN
.
43
4.2.2.
SYSTEMATISCHE ANALYSE
VERSCHIEDENER
STADIEN
DES
VEGETATIVEN
LEBENSZYKLUS
VON
V.
CARTERI
AUF
YPTV-PROTEINE
.
44
4.2.3.
APPARENTES MOLEKULARGEWICHT
VON
YPTV3
IN
.
46
VOZVOX-GESAMTPROTEINEXTRAKTEN
.
46
4.3.
SUBZELLULAERE
LOKALISIERUNG
DER
YPTV-PROTEINE
IN
.
47
ZELLEN
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII.
.
47
4.3.1.
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
YPTV-PROTEINE
IM
CYTOSOL
UND
IN
MEMBRANEXTRAKTEN
VON
V.
CARTERI-GESAMTZELL-LYSATEN
47
4.3.2.
YPTV-LOKALISIERUNG
DURCH
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
MIKROSKOPIE
IN
V.
CARTERI-SOMAZELLEN
UND
-EMBRYONEN
.
49
4.3.3.
YPT-LOKALISIERUNG
IN
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII-ZELLEN
DURCH
IMMUNGOLDMARKIERUNGS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
57
4.4.
EXPERIMENTE
ZUR
MOEGLICHEN
FUNKTION
VON
YPTCL
IN
DER
KONTRAKTILEN
VAKUOLE
VON
CHLAMYDOMONAS
.
63
4.4.1.
EINFLUSS
AEUSSERER
OSMOTISCHER
BEDINGUNGEN
AUF
DIE
.
TRANSKRIPTION
VON
YPTCL
IN
C.
REINHARDTII.
63
4.4.2.
EINFLUSS
UNTERSCHIEDLICHER
OSMOTISCHER
BEDINGUNGEN
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
YPTCL-PROTEINS
IN
C.
MOEWUSII
UND
C.
MOEWUSII
S-16
.
64
4.5.
LOKALISIERUNG
VON
YPT-PROTEINEN
IN
DEN
FLAGELLEN
.
66
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
.
66
4.5.1.
LOKALISIERUNG
DER
Y
PTV
-PROTEINE
IN
DEN
FLAGELLEN
VON
.
V.
CARTERI
DURCH
IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE
.
66
4.5.2.
YPT-NACHWEIS
IN
ISOLIERTEN
FLAGELLEN
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
MITTELS
WESTERN-ANALYSE
.
67
4.4.3.
ANALYSE
DER
YPC-TRANSKRIPTMENGEN
IN
C.
REINHARDTII
NACH
DEFIAGELLIERUNG
UND
HAGELLENREGENERATION
.
70
INHALTSVERZEICHNIS
VII
5.
DISKUSSION
.
73
5.1.
ELEKTROPHORETISCHES
VERHALTEN
DER
YPTV-PROTEINE
.
73
5.2.
LOKALISATION
UND
FUNKTION
DER
YPT-PROTEINE
IM
ZELLKOERPER
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
.
YY
.
74
5.2.1.
MEMBRANASSOZIATION
UND
EXPRESSION
DER
YPT-PROTEINE
IN
V.
CARTERI
.
75
5.2.2.
YPT-LOKALISATION
UND
-FUNKTION
AN
KOMPARTIMENTEN
DER
KONSTITUTIVEN
SEKRETION
.
77
5.3.
LOKALISATION
UND
FUNKTION
DER
YPT-PROTEINE
IN
DEN
FLAGELLEN
VON
V.
CARTERI
UND
C.
REINHARDTII
.
83
5.4.
AUSBLICK
.
87
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
88
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
90 |
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