Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression mit Antigen-Toxin-Konjugaten:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DAS
IMMUNSYSTEM
.
1
1.1.1
ZELLEN
DES
IMMUNSYSTEMS
.
1
1.1.2
ANTIGENPRAESENTATION
UND
ZELLVERMITTELTE
ZYTOTOXIZITAET
.
4
1.2
AUTOIMMUNERKRANKUNGEN
.
6
1.2.1
IMMUNOLOGISCHE
TOLERANZ
.
6
1.2.2
URSACHEN
FUER
AUTOIMMUNERKRANKUNGEN
.
9
1.3
IMMUNOTOXINE
.
14
1.3.1
WIRKUNGSMECHANISMUS
.
14
1.3.2
DIE
LIGANDENKOMPONENTE
.
16
1.3.3
DIE
TOXINKOMPONENTE
.
17
1.3.4
KOPPLUNGSREAGENZIEN
.
20
1.4
ANTIGENSPEZIFISCHE
IMMUNSUPPRESSION
.
22
1.5
METHODEN
ZUR
ZELLSEPARATION
.
24
1.5.1
UEBERBLICK
UND
BEWERTUNG
.
24
1.5.2
ZELLSEPARATION
MIT
MAGNETISCHEN
PARTIKELN
.
25
2
AUFGABENSTELLUNG
.
29
3
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
31
3.1
MEMBRANANTIGENE
MURINER
LYMPHOZYTEN
.
31
3.2
NACHWEIS
ZELLULAERER
MEMBRANANTIGENE
.
33
3.2.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
33
3.2.2
IMMUNCYTOCHEMISCHE
FAERBETECHNIK
.
34
3.3
ZELLSEPARATION
.
37
3.3.1
SEPARATION
MIT
NYLONWOLLE
.
37
3.3.2
DIREKTE
IMMUNMAGNETISCHE
SEPARATION
.
40
3.3.3
INDIREKTE
IMMUNMAGNETISCHE
SEPARATION
.
43
3.4
ANTIGEN-BLOCKED-RICIN-KONJUGATE
.
56
3.4.1
SYNTHESE
.
56
3.4.1.1
EINBAU
VON
MALEIMIDGRUPPEN
IN
PEROXIDASE
.
56
3.4.1.2
REDUKTION
VON
BLOCKIERTEM
RICIN
.
57
3.4.1.3
KOPPLUNGSREAKTION
.
58
3.4.1.4
AUFARBEITUNG
DES
REAKTIONSGEMISCHES
.
59
3.4.1.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
BLOCKED-RICIN-KONJUGATE
.
59
3.4.2
IN
VITRO
VERSUCHE
.
61
3.4.2.1
IN
VITRO
VERSUCHE
AN
GEMISCHTEN
LYMPHOZYTEN
.
61
3.4.2.2
IN
VITRO
VERSUCHE
AN
B-LYMPHOZYTEN
.
78
3.5
ANTIGEN-GELONIN-KONJUGATE
.
89
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.1
SYNTHESE
.
89
3.5.1.1
EINBAU
VON
THIOLGRUPPEN
IN
PEROXIDASE
.
89
3.5.1.2
EINBAU
VON
THIOLGRUPPEN
IN
GELONIN
.
89
3.5.1.3
EINBAU
VON
MALEIMIDGRUPPEN
IN
GELONIN
.
89
3.5.1.4
KOPPLUNGSREAKTION
UND
AUFARBEITUNG
.
89
3.5.1.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
GELONIN-KONJUGATES
.
90
3.5.2
IN
VITRO
VERSUCHE
.
92
4
ZUSAMMENFASSUNG
.
97
5
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
101
5.1
MATERIALIEN
.
101
5.1.1
REAGENZIEN
.
101
5.1.2V
ERBRAUCHSMATERIAL
.
103
5.1.3
ZELLINIEN
.
103
5.2
ALLGEMEINE
METHODEN
.
104
5.2.1
PROTEINBESTIMMUNG
.
104
5.2.1.1
UV/VIS-METHODE
.
104
5.2.1.2
BCA-METHODE
.
104
5.2.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
105
5.2.3
GELFAERBEMETHODEN
.
106
5.2.3.1
COOMASSIE-FAERBUNG
.
106
5.2.3.2
SILBERFAERBUNG
.
107
5.2.4
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
107
5.2.5
DIALYSE
.
107
5.2.6
IN
VITRO
TRANSLATIONSTEST
.
108
5.2.7
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
PROTEIN-G-SEPHAROSE
.
110
5.3
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
112
5.3.1
IMMUNISIERUNG
VON
VERSUCHSTIEREN
.
112
5.3.2
GEWINNUNG
VON
IMMUNSEREN
.
112
5.3.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
113
5.3.4
IMMUNFLUORESZENZ
.
115
5.3.5
ZELL-ELISA
MIT
UNFIXIERTEN
ZELLEN
.
117
5.3.6
ZELL-ELISA
MIT
FIXIERTEN
ZELLEN
.
118
5.4
SYNTHESE
DES
HRP-BLOCKED-RICIN-KONJUGATES
.
122
5.4.1
EINBAU
VON
MALEIMIDGRUPPEN
IN
PEROXIDASE
.
122
5.4.2
REDUKTION
VON
BLOCKIERTEM
RICIN
.
122
5.4.3
KOPPLUNGSREAKTION
.
122
5.4.4
AUFARBEITUNG
DES
REAKTIONSGEMISCHES
.
123
5.5
SYNTHESE
DES
HRP-GELONIN-KONJUGATES
.
124
5.5.1
EINBAU
VON
THIOLGRUPPEN
IN
PEROXIDASE
.
124
5.5.2
EINBAU
VON
THIOLGRUPPEN
IN
GELONIN
.
124
5.5.3
EINBAU
VON
MALEIMIDGRUPPEN
IN
GELONIN
.
124
INHALTSVERZEICHNIS
III
5.5.4
KOPPLUNGSREAKTION
UND
AUFARBEITUNG
.
125
5.6
ZELLKULTUR
.
126
5.6.1
ALLGEMEINES
.
126
5.6.1.1
ALLGEMEINE
KULTURBEDINGUNGEN
.
126
5.6.1.2
STERILISATION
VON
MEDIEN
UND
GERAETEN
.
126
5.6.1.3
ZELLEN
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
.
126
5.6.1.4
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
126
5.6.1.5
HITZEINAKTIVIERUNG
VON
FOETALEM
KAELBERSERUM
.
127
5.6.2
RATTEN-HYBRIDOMZELLINIE
30H12
.
127
5.6.3
MAUS-HYBRIDOMZELLINIE
ZAG
2
.
128
5.6.4
MURINE
T-ZELLINIE
CTLL-2
.
128
5.6.5
HUMANE
STAMMZELLINIE
KG-1
.
130
5.6.6
MURINE
MILZZELLEN
.
130
5.6.6.1
ISOLIERUNG
.
130
5.6.6.2
LYSE
DER
ERYTHROZYTEN
.
132
5.6.6.3
KULTURBEDINGUNGEN
.
132
5.7
ZELLSEPARATION
.
134
5.7.1
SEPARATION
MIT
NYLON-WOLLE
.
134
5.7.1.1
VORBEREITUNG
DER
NYLONWOLLE
.
134
5.7.1.2
SEPARATION
.
134
5.7.2
DIREKTE
IMMUNMAGNETISCHE
SEPARATION
.
135
5.7.2.1
KOPPLUNG
DER
ANTIKOERPER
AN
DIE
MAGNETPARTIKEL
.
135
5.7.2.2
SEPARATION
.
137
5.7.3
INDIREKTE
IMMUNMAGNETISCHE
SEPARATION
.
138
5.7.3.1
EINFACHSEPARATION
.
138
5.7.3.2
DOPPELSEPARATION
.
139
5.8
PROLIFERATIONSASSAY
.
141
5.9
IN
VITRO
ZYTOTOXIZITAETSASSAY
.
143
5.9.1
STANDARDMETHODE
.
143
5.9.2
ZEITABHAENGIGE
METHODE
.
144
6
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
147
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
151 |
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