Etablierung von HLA DR1 und human CD4-HLA DR1 transgenen Mauslinien: Charakterisierung einer Antigen-spezifischen Immunantwort
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DAS IMMUNSYSTEM UND SEINE AUFGABEN. 1
1.2 T-ZELLENTWICKLUNG. 2
1.3 ANTIGENERKENNUNG DURCH T-LYMPHOZYTEN. 3
1.4 INTERAKTION ZWISCHEN CD4- UND MHC-KLASSE II-MOLEKUELEN. 7
1.5 ENTSTEHUNG EINER IMMUNANTWORT. 9
1.6 TRANSGENE TIERMODELLE IN DER BIOLOGISCHEN FORSCHUNG. 11
1.7 ZIELSETZUNG DER ARBEIT. 12
2 MATERIAL UND METHODEN 15
2.1 MATERIALIEN. 15
2.1.1 CHEMIKALIEN, RADIOCHEMIKALIEN, PRAEPARATIONS-KITS. 15
2.1.2 ENZYME. 16
2.1.3 COSMIDE UND VEKTOREN. 16
2.1.4^ BAKTERIENSTAEMME, ZELLINIEN, MAUSSTAEMME. 16
2.1.5 OLIGONUKLEOTIDE UND SONDEN. 17
2.1.6 ANTIKOERPER. 19
2.1.7 FESTMATERIAL. 19
2.1.8 HAEUFIG VERWENDETE LOESUNGEN.20
2.2 METHODEN. 21
2.2.1 ARBEITEN MIT DNA. 21
2.2.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MAOESTAB . 21
2.2.1.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB . 22
2.2.1.3 PRAEPARATION VON COSMID-DNA. 22
2.2.1.4 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS MAUSSCHWANZSPITZEN 23
2.2.1.5 SCHNELLVERFAHREN ZUR ISOLIERUNG VON DNA AUS MAUS
SCHWANZSPITZEN FUER DIE PCR.24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.6 PHENOL- UND CHLOROFORM-EXTRAKTION VON DNA. 24
2.2.1.7 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN . 24
2.2.1.8 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA. 25
2.2.1.9 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA.25
2.2.1.10 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
. 25
2.2.1.11 REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 28
2.2.1.12 SPEKTROMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN. 28
2.2.1.13 KLONIERUNG ISOLIERTER DNA-FRAGMENTE.29
2.2.1.14 TRANSFEKTION VON BAKTERIENZELLEN. 30
2.2.1.15 TRANSFEKTION VON DNA IN EUKARYOTISCHE ZELLEN.31
2.2.1.16 TRANSFER VON DNA AUF MEMBRANEN (SOUTHERN BLOTTING) . . 32
2.2.1.17 HERSTELLUNG UND RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 32
2.2.1.18 HYBRIDISIERUNG VON NITROZELLULOSEGEBUNDENER DNA MIT RA
DIOAKTIV MARKIERTEN SONDEN. 33
2.2.1.19 DNA-SEQUENZIERUNG. 34
2.2.1.20 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ZUR AMPLIFIKATION VON
DNA. 36
2.2.2 METHODEN ZUR ANALYSE VON RNA . 37
2.2.2.1 ISOLIERUNG DER GESAMTZELLULAEREN RNA AUS GEWEBE.37
2.2.2.2 PRAEPARATION VON POLYA
+-RNA AUS BLUTLYMPHOZYTEN . 38
2.2.2.3 ELEKTROPHORESE VON RNA IN FORMALDEHYD-GELEN. 38
2.2.2.4 TRANSFER VON RNA AUF MEMBRANEN (NORTHERN BLOTTING) . . 39
2.2.2.5 HYBRIDISIERUNG MEMBRANGEBUNDENER RNA MIT RADIOAKTIV
MARKIERTEN DNA-SONDEN. 39
2.2.2.6 REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA (RT-PCR). 39
2.2.3 FLUORESZENZMARKIERUNG VON ANTIKOERPERN MIT BIOTIN.40
2.2.4 HERSTELLUNG DER TRANSGENEN MAEUSE. 41
2.2.4.1 DRA-TRANSGEN. 41
2.2.4.2 DRL/?-CDNA.41
2.2.4.3 DRLSS-GENOMISCHE DNA. 43
2.2.4.4 DAS TRANSGEN HUMAN CD4 . 44
2.2.4.OE MIKRO-EIINJEKTIONEN DER TRANSGENE. 44
2.2.5 IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN MIT ANTIGEN.45
2.2.5.1 EMULSION DES ANTIGENS IN VERSCHIEDENEN ADJUVANTIEN . 45
2.2.5.2 IMMUNISIERUNG DER MAEUSE IN DIE HINTEREN FUSSPFOTEN
. 46
2.2.6 PRAEPARATION VON ZELLEN AUS VERSUCHSTIEREN. 46
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.2.6.1 ISOLIERUNG VON LYMPHOZYTEN AUS MILZ, THYMUS, LYMPH
KNOTEN UND KNOCHENMARK.46
2.2.6.2 ISOLIERUNG VON LYMPHOZYTEN AUS DEM BLUT FUER FACS-
ANALYSEN.47
2.2.6.3 ISOLIERUNG VON LYMPHOZYTEN AUS DEM BLUT FUER PROLIFERATI
ONSEXPERIMENTE .47
2.2.7 METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER TRANSGENEN TIERE.48
2.2.7.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE VON LYMPHOZYTEN AUS ORGANEN UND
BLUT.48
2.2.7.2 GEMISCHTE LYMPHOZYTENREAKTION (MLR) VON MILZZELLEN . . 49
2.2.7.3 SEKUNDAERE
IN VITRO RESTIMULATION VON IN VIVO AKTIVIERTEN
LYMPHKNOTENZELLEN. 50
2.2.7.4 SPEZIFISCHE INHIBITION DER T-ZELLPROLIFERATION DURCH
BLOCKIERENDE ANTIKOERPERN IN VITRO.50
2.2.7.5 FREQUENZANALYSE VON IN VIVO REAKTIVEN ANTIGEN SPEZIFI
SCHEN LYMPHKNOTENZELLEN (LIMITING DILUTION ASSAY) . 51
2.2.7.6 KOPIENZAHL DER GENOMISCH INTEGRIERTEN TRANSGENE.53
2.2.8 HISTOLOGISCHE UND IMMUNOZYTOCHEMISCHE ANALYSE VON GEWEBE
SCHNITTEN .*.54
3 ERGEBNISSE 55
3.1 KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG DER HLA DRL-TRANSGENEN MAUS .
55
3.1.1 TRANSGTAE DNA-KONSTRUKTE.55
3.1.1.1 D RA-TRANSGEN.55
3.1.1.2 DRL/?-TRANSGEN.56
3.1.2 EXPRESSION DER TRANSGENEN DNA-KONSTRUKTE IN MAUS-ZELLINIEN . 58
3.1.3 MIKRO-EIINJEKTIONEN DER TRANSGENEN DNA-KONSTRUKTE.58
3.1.4 PCR-ANALYSE.60
3.1.5 SOUTHERN BLOT-ANALYSE. 62
3.1.6 REVERSE TRANSKRIPTASE-PCR.64
3.1.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG DER PERIPHEREN BLUTLYMPHO
ZYTEN .66
3.1.8 ZUSAMMENFASSUNG.69
3.2 HERSTELLUNG EINER HCD4-HLA DRL-TRANSGENEN MAUSLINIE.70
3.2.1 HUMAN CD4-TRANSGENE MAUS . 70
3.2.2 HCD4-HLA DRL-TRANSGENE MAUS. 72
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3 TYPISIERUNG DER NACHKOMMENSCHAFT. 76
3.3 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNG DER HLA DR1- UND HCD4-HLA DRL-TRANSGE-
NEN MAUSLINIEN. 77
3.3.1 KOPIENZAHL DER IN DAS MAUSGENOM INTEGRIERTEN TRANSGENE. 77
3.3.2 NORTHERN BLOT-ANALYSEN. 80
3.3.3 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNG VON LYMPHATISCHEN ORGANEN
UND DEM BLUT. 83
3.3.4 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG. 88
3.3.5 ZUSAMMENFASSUNG. 93
3.4 TCR V^-KETTEN-REPERTOIRE. 94
3.5 CHARAKTERISIERUNG DER IMMUNANTWORT IN HLA DR1- UND HCD4-HLA DR1-
TRANSGENEN MAEUSEN. 95
3.5.1 T-ZELLANTWORT NACH IMMUNISIERUNG MIT EINEM ANTIGENEN PEPTID . 96
3.5.2
IN VITRO CHARAKTERISIERUNG DER IMMUNANTWORT. 99
3.5.2.1 DAS HLA DRL-MOLEKUEL ALS EINZIGES ANTIGEN PRAESENTIEREN
DES MOLEKUEL.100
3.OE.2.2 DIE SYNGENE INTERAKTION ZWISCHEN HCD4- UND DR1-
MOLEKUELEN UEBERWIEGT IN ANWESENHEIT VON MURINEM CD4 . 102
3.5.3 BESTIMMUNG DER FREQUENZ IN VIVO AKTIVIERTER, ANTIGEN-REAKTIVER
LYMPHOZYTEN.103
3.5.4 ERHOEHTE EXPRESSION VON ZELLOBERFLAECHENMARKERN.105
3.5.5 ZUSAMMENFASSUNG.112
4
DISKUSSION 115
4.1 EINFUEHRUNG .115
4.2 ETABLIERUNG HLA DRL- UND HCD4-HLA DRL-TRANSGENER MAUSLINIEN
. 117
4.3 GEWEBESPEZIFISCHE EXPRESSION DER DRL- UND HCD4-TRANSKRIPTE UND
-PROTEINEI 18
4.4 TCR VSS-KETTEN-REPERTOIRE.124
4.5 CHARAKTERISIERUNG DER ANTIGEN/DRL-SPEZIFISCHEN IMMUNANTWORT IN HLA
DRL-TRANSGENEN MAEUSEN IN AN- UND ABWESENHEIT VON TRANSGENEN HCD4-
MOLEKUELEN.126
4.6 AUSBLICK AUF WEITERE EXPERIMENTE.132
5
ZUSAMMENFASSUNG 135
LITERATURVERZEICHNIS
137 |
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