Klonierung und Expression des humanen TNF-Rezeptors TR80 und eines chimären TR80/60 TNF-Rezeptors:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
5
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
8
ZUSAMMENFASSUNG.
.
10
1
EINLEITUNG
.
12
1.1
ZYTOKINE
UND
ZYTOKINREZEPTOREN
.
12
1.2
TUMOR
NEKROSE
FAKTOR
.
14
1.3
STRUKTUR
DES
TNFS
.
15
1.4
SYNTHESE
DES
TNFS
.
16
1.5
TNF-REZEPTOREN
UND
DEREN
KLONIERUNG
.
17
1.6
STRUKTUR
DER
TNF-REZEPTOREN
.
18
1.7
SIGNALTRANSDUKTION
DER
TNF-REZEPTOREN
.
19
1.8
ROLLE
DES
TNFS
IN
VIVO
.
21
1.8.1
SEPTISCHER
SCHOCK
.
21
1.8.2
KACHEXIE
.
22
1.8.3
INFEKTIONEN
MIT
BAKTERIEN
UND
PARASITEN
.
22
1.8.4
HIV
INFEKTION
.
23
1.8.5
RHEUMATOIDE
ARTHRITIS
.
23
1.8.6
KREBS
.
24
1.9
FRAGESTELLUNG
.
24
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
26
2.1
REAGENZIEN
.
26
2.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
29
2.3
EXPERIMENTALMETHODEN
.
32
2.3.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
AUSE.COLI
.32
2.3.2
AUFREINIGUNG
VON
PLASMID
DNA
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
32
2.3.3
SPALTUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
33
2.3.4
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
33
2.3.5
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
34
2.3.6
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
34
2.3.7
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
2.3.8
KOLONIE-SCREENING
DURCH
YYKOLONIE
LIFTING
"
.
36
2.3.9
HERSTELLUNG
VON
ELEKTROKOMPETENTEN
E.COLI-ZELLEN
.
36
2.3.10
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
MIT
PLASMID
DNA
.
36
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.11
TRANSFORMATION
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION.
37
2.3.12
YYSCREENING
"
VON
GENBANKEN
DURCH
DNA-DNA
HYBRIDISIERUNG
.
37
2.3.13
.EXPRESSIONSSCREENING
"
EINER
SCHISTOSOMA-CDNA
GENBANK
MIT
125
J-TNF
.
38
2.3.14
DNA
SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDESOXY-METHODE
.
39
2.3.15
PCR
(
YYPOLYMERASE
CHAIN
REACTION
"
)
.
40
2.3.16
IN
VITRO-EXZISION
VON
INSERTS
AUS
X
PHAGEN
.
41
2.3.17
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
TR
80-PMAM
NEO
.
42
2.3.18
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
TR
80-PVL
1393
.
43
2.3.19
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
TR
80-BMG
NEO
.
44
2.3.20
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
TR
80-PEF-BOS
.
45
2.3.21
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRAN
(
SOUTHERN
BLOT
)
.
46
2.3.22
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRAN
(
WESTERN
BLOT
)46
2.3.23
IMMUNOBLOTANALYSE
.
47
2.3.24
IMMUNPRAEZIPITATION
.
47
2.3.25
IMMUNFLUORESZENZANALYSEN
.
48
2.3.26
SAETTIGUNGSBINDUNGSSTUDIEN
.
48
2.3.27
ZYTOTOXIZITAETSBESTIMMUNG
.
49
2.3.28
SS-GALAKTOSIDASENACHWEIS
IN
TRANSFIZIERTEN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN.
49
2.3.29
MNSOD
BESTIMMUNG
.
50
2.3.30
IL
6
BESTIMMUNG
.
51
3
ERGEBNISSE
.
52
3.1
KLONIERUNG
DES
HUMANEN
TR80
REZEPTORS
.
52
3.1.1
ANALYSE
DER
HUMANEN
PLAZENTA
GENBANK
.
52
3.1.2
ANALYSE
EINER
GENBANK
AUS
CAMP-STIMULIERTEN
HL
60-ZELLEN
.
55
3.2
KONSTRUKTION
EINES
TR
80/60-CHIMAEREN
REZEPTORS
.
63
3.3
TRANSFEKTION
VON
HEIA
ZELLEN
.
66
3.4
EXPRESSION
DES
TR
80
REZEPTORS
.
68
3.5
EXPRESSION
DES
CHIMAEREN
TR80/60
IN
HEIA
ZELLEN
.
70
3.6
NACHWEIS
DES
EXPRIMIERTEN
TR
80
UND
TR80/60
IM
WESTERN
BLOT
.
74
3.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
TNF
REZEPTOREN
DER
TR
80
TRANSFEKTANDEN
DURCH
SAETTIGUNGSBINDUNGSSTUDIEN
.
77
3.8
KOMPETITIONSSTUDIEN
AN
TR
80
TRANSFEKTANDEN
.
80
3.9
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DES
EXPRIMIERTEN
TR80
PROTEINS
UND
DES
CHIMAEREN
TR80/60
REZEPTORS
.
83
INHALTSVERZEICHNIS
7
3.9.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZYTOTOXIZITAET
.
83
3.9.2
REAKTION
VON
TR80-TRANSFEKTANDEN
AUF
LYMPHOTOXIN
.
87
3.9.3
WIRKUNG
VON
TNF
UND
M80
SERUM
AUF
HEIA
TR80/60
TRANSFEKTANDEN89
3.9.4
EXPRESSION
VON
MNSOD
.
92
3.9.5
EXPRESSION
VON
IL6
.
95
3.10
SUCHE
NACH
TNF-REZEPTOREN
IN
SCHISTOSOMEN
.
98
3.10.1
YYSCREENING
"
VON
SCHISTOSOMA
CDNA-BANKEN
.
98
4
DISKUSSION
.
,
.
102
4.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
HUMANEN
TR80
.
102
4.2
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DES
EXPRIMIERTEN
REZEPTORS
.
104
4.3
INDUKTION
DER
MNSOD
.
HO
4.4
UNTERSUCHUNGEN
AM
TR80/60
REZEPTOR
.
112
4.4.1
ZYTOTOXIZITAETSUNTERSUCHUNGEN
AN
HEIA
TR80/60
.
113
4.4.2
INDUKTION
VON
MNSOD
UND
IL6
BEI
HELA-TR80/60
.
114
4.5
TNF
REZEPTOREN
IN
SCHISTOSOMEN
?
.
116
5
LITERATURVERZEICHNIS
.
120 |
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