Der Translations-Initiationsfaktor 2 aus Thermus thermophilus HB8:
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1995
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I
NHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
V
1
EINLEITUNG
------------------------------------------------------------------------------------------------------
1
11
DIE
INITIATION
BENOETIGT
EINE
SPEZIFISCHE
TRNA
-----------------------------------------------------
1
1.2
BESTIMMTE
MRNA
BEREICHE
SIND
WICHTIG
FUER
DIE
INITIATION
------------------------------------
3
1.3
FUER
DIE
INITIATION
AN
NATUERLICHEN
MRNAS
SIND
DREI
PROTEINFAKTOREN
NOTWENDIG
--------
4
1.3.1
IF1
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
4
1.3.2
IF2
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
5
1.3.3
IF3
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
8
1.4
DAS
AKTUELLE
MODEL)
ZUR
INITIATION
DER
PROTEINBIOSYNTHESE
------------------------------------
9
1.5
DIE
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
----------------------------------------------------------------
10
1.5.1
DIE
FUNKTION
DES
EF-TU
IN
DER
ELONGATION
DER
TRANSLATION
-------------------------
11
1.5.2
DER
IF2
ALS
GDP/GTP-BINDENDES
PROTEIN
------------------------------------------------
12
1.5.3
IST
IF2
EIN
INITIATIONSSPEZIFISCHER
EF-TU
?
------------------------------------------------
13
1.6
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
----------------------------------------------------------------------------------
14
2
MATERIALIEN
UND
METHODEN
-----------------------------------------------------------------------------
15
2.1
MATERIALIEN
-------------------------------------------------------------------------------------------------
15
2.1.1
BAKTERIENSTAEMME
---------------------------------------------------------------------------------
15
2.1.2
PLASMIDE,
PHAGMIDE
UND
BAKTERIOPHAGEN
------------------------------------------------
15
2.1.3
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
--------------------------------------------------------------------
16
2.1.4
NAEHRMEDIEN
UND
LOESUNGEN
-------------------------------------------------------------------
17
2.1.4.1
MEDIEN
------------------------------------------------------------------------------------
17
2.1.4.2
LOESUNGEN
---------------------------------------------------------------------------------
17
2.1.5
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
PROTEINE
---------------------------------------------------------
18
2.1.5.1
BIOCHEMIKALIEN
--------------------------------------------------------------------------
18
2.1.5.2
CHROMATOGRAPHIE-MATERIALIEN
-----------------------------------------------------
18
2.1.5.3
ENZYME
-----------------------------------------------------------------------------------
19
2.1.5.4
PROTEINE
-----------------------------------------------------------------------------------
19
2.1.5.5
RADIOCHEMIKALIEN
---------------------------------------------------------------------
19
2.1.6
COMPUTERPROGRAMME
----------------------------------------------------------------------------
19
2.2
METHODEN
---------------------------------------------------------------------------------------------------
20
2.2.1
STANDARDMETHODEN
-------------------------------------------------------------------------------
20
2.2.1.1
ABSORPTIONSMESSUNG
-----------------------------------------------------------------
20
2.2.1.2
ZENTRIFUGATIONEN
-----------------------------------------------------------------------
20
2.2.1.3
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
---------------------------------------------------------------
20
2.2.2
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
-----------------------------------------------------------
21
II
2.2.2.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
-----------------------------------------
2
2.2.2.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
---------------------------------------------------------
2.2.23
HARNSTOFF-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
----------------------------------
3
2.2.3
PROTEINTRANSFER
AUF
PVDF-MEMBRANEN
----------------------------------------------------
2
2.2.4
IMMUNO-FAERBUNG
---------------------------------------------------------------------------------
2
2.2.5
PROTEINSEQUENZIERUNG
---------------------------------------------------------------------------
2
2.2.6
PRAEPARATION
DES
IF2
AUS
THERMUS
THERMOPHILUS
----------------------------------------
2
2.2.6.1
CHEMISCHE
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
APUPG
--------------------------
2
2.2.Q.2
DARSTELLUNG
VON
N
10
-FORMYLTETRAHYDROFOLAT
------------------------------------
2
2.2.6.3
PARTIELLE
REINIGUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
METHIONYL-TRNA-SYNTHETASE
J
UND
ESCHERICHIA
COLI
FORMYLTRANSFERASE
------------------------------
2
2.2.6.4
BIOCHEMISCHE
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
FMET-TRNA
F
RNET
--------------
2
2.2.6.5
REINIGUNG
VON
THERMUS
THERMOPHILUS
70S-RIBOSOMEN
-------------------
2
2.2.6.6
AKTIVITAETSTEST
FUER
DEN
IF2
------------------------------------------------------------
I
2.2.67
ZELLAUFSCHLUSS
----------------------------------------------------------------------------
2
2.2.6.8
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DES
IF2
---------------------------------------
2
2.27
PRAEPARATION
VON
UEBERPRODUZIERTEM
THERMUS
THERMOPHILUS
IF2
AUS
E.
COLI
-
3L
2.27.1
ZELLAUFSCHLUSS
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
-----------------------------------------
31
2.27.2
PRAEPARATIVER
ZELLAUFSCHLUSS
UND
HITZEDENATURIERUNG
-----------------------
3L
2.27.3
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
--------------------------------------------------
3(
2.2.8
HYDROLYSESCHUTZ-EXPERIMENTE
----------------------------------------------------------------
31
2.2.9
NUKLEOTIDANALYSE
---------------------------------------------------------------------------------
3'
2.2.10
REINIGUNG
VON
DNA
---------------------------------------------------------------------------
3,
2.2.10.1
ANALYTISCHE
PLASMIDISOLIERUNG
---------------------------------------------------
31
2.2.10.2
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
---------------------------------------------------
32
2.2.10.3
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
THERMUS
THERMOPHILUS
-----
32
2.2.10.4
REINIGUNG
VON
PHAGMID-SSDNA-
-
-
-
-
-
-
-
-
33
2.2.11
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
-----------------------------------------------------
33
2.2.11.1
VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
---------------------------------------
33
I
2.2.11.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
-----------------------------------------------------------------
33
2.2.11.3
LIGATION
----------------------------------------------------------------------------------
33
2.2.11.4
NICK-TRANSLATION
-----------------------------------------------------------------------
34
2.2.11.5
HERSTELLUNG
VON
UNIDIREKTIONALEN
DELETIONSKLONEN
MIT
EXONUKLEASE
III
-----------------------------------------------------------
34
2.2.12
DNA
UEBERTRAGUNG
-------------------------------------------------------------------------------
34
2.2.12.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
-------------------------------------------------
34
2.2.12.2
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
--------------------------------------------
34
2.2.13
HYBRIDISIERUNGEN
--------------------------------------------------------------------------------
34
2.2.13.1
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
-----------------------------------------------------------
35
2.2.13.2
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
EINER
GROESSENSELEKTIERTEN
PLASMID-GENBANK
35
I
NHALTSVERZEICHNIS
III
2.2.14
DNA
SEQUENZIERUNG
--------------------------------------------------------------------------
35
2.2.14.1
SEQUENZIERUNG
VON
SSDNA
UND
DSDNA
MIT
T7-DNA-POLYMERASE
-
36
2.2.14.2
SEQUENZIERUNG
VON
DSDNA
MIT
SEQUITHERM
DNA
POLYMERASE
-------
36
2.2.14.3
DIREKTE
SEQUENZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
MIT
ATAQ
DNA
POLYMERASE
----------------------------------------------------------------
36
2.2.15
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
----------------------------------------------------------------
37
2.2.15.1
VORBEREITUNG
DER
TEMPLATE
DNA
------------------------------------------------
37
2.2.15.2
PCR
REAKTIONEN
---------------------------------------------------------------------
37
2.2.15.3
VORBEREITUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
FUER
DIE
KLONIERUNG
-------------------
37
3
ERGEBNISSE
--------------------------------------------------------------------------------------------------
38
3.1
REINIGUNG
DES
IF2
AUS
THERMUS
THERMOPHILUS
-------------------------------------------------
38
3.1.1
ZELLULAERE
LOKALISATION
DES
IF2
----------------------------------------------------------------
38
3.1.2
DER
IF2-AKTIVITAETSTEST
----------------------------------------------------------------------------
39
3.1.3
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFREINIGUNG
VON
IF2
----------------------------------------------
40
3.1.4
PROTEOLYTISCHER
ABBAU
DES
PROTEINS
UND
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
----------
44
3.1.5
ANALYSE
DES
GEBUNDENEN
NUKLEOTIDS
------------------------------------------------------
47
3.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
INFB-GENS
-----------
47
3.2.1
KLONIERUNG
DES
INFB-GENS
---------------------------------------------------------------------
47
3.2.2
DIE
VOM
THERMUS
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERON
KODIERTEN
PROTEINE
---------
52
3.2.3
ORGANISATION
DES
SEQUENZIERTEN
BEREICHES
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERONS
----------------------------------------------------------------------
60
3.3
UEBEREXPRESSION
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
INFB-GENS
IN
ESCHERICHIA
COLI
-----------
62
3.3.1
KONSTRUKTION
EINES
EXPRESSIONSVEKTORS
---------------------------------------------------
62
3.3.2
UEBERPRODUKTION
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
IF2
IN
ESCHERICHIA
COLI
DH5A/PEX-INFB/PREP4
-------------------------------------------------------------------------
64
3.4
AUFREINIGUNG
DES
UEBERPRODUZIERTEN
PROTEINS
---------------------------------------------------
66
3.4.1
HITZEDENATURIERUNG
UND
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
---------------------------
66
3.4.2
N-TERMINALE
SEQUENZ
DES
UEBERPRODUZIERTEN
PROTEINS
---------------------------------
68
3.5
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
IF2
UND
DER
INITIATOR-TRNA
--------------------------------------
69
3.5.1
HYDROLYSESCHUTZEXPERIMENTE
-----------------------------------------------------------------
69
4
DISKUSSION
--------------------------------------------------------------------------------------------------
70
4.1
DER
IF2
AUS
THERMUS
THERMOPHILUS
----------------------------------------------------------------
70
4.1.1
DAS
PROTEIN
IST
NACH
ZELLAUFSCHLUSS
NICHT
MIT
DEN
RIBOSOMEN
ASSOZIIERT
------
70
4.1.2
DER
GEREINIGTE
IF2
IST
NICHT
KATALYTISCH
AKIV
---------------------------------------------
72
4.1.3
EIN
PROTEOLYSE-SENSITIVER
BEREICH
VERBINDET
ZWEI
DOMAENEN
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
IF2
--------------------------------------------------------------------------
73
IV
4.2
DAS
NUSALINFB-OPERON
AUS
THERMUS
THERMOPHILUS
------------------------------------------
7;
4.2.1
DIE
ORGANISATION
DES
NUSALINFB-OPERONS
IST
IN
THERMUS
THERMOPHILUS,
|
BACILLUS
SUBTILIS
UND
ESCHERICHIA
COLI
AEHNLICH
-------------------------------------------
7
4.2.2
KODONVERWENDUNG
IM
T.
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERON
UND
AMINOSAEUREZU-1
SAMMEN-SETZUNG
DER
KODIERTEN
PROTEINE
-------------------------------------------------
8
4.2.3
DIE
EXPRESSION
DES
T.
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERONS
KOENNTE
DURCH
MRNA
SEKUNDAERSTRUKTUREN
REGULIERT
SEIN
-----------------------------------------------------------
8
4.3
UEBEREXPRESSION
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
INFB-GENS
IN
ESCHERICHIA
COLI
-----------
8I
4.4
DER
UEBERPRODUZIERTE
IF2
WIRD
NICHT
VOLLSTAENDIG
PROZESSIERT
-------------------------------
8
4.5
DOMAENENORGANISATION
DES
THERMUS
THERMOPHILUS
IF2
--------------------------------------
8
4.5.1
DOMAENE
I
--------------------------------------------------------------------------------------------
8
4.5.2
DIE
G-DOMAENE
------------------------------------------------------------------------------------
9
4.5.3
DOMAENE
III
------------------------------------------------------------------------------------------
4.5.4
DIE
C-TERMINALE
DOMAENE
-----------------------------------------------------------------------
9
4.5.5
WECHSELWIRKUNG
DES
IF2
MIT
DER
INITIATOR-TRNA
----------------------------------------
9I
4.6
AUSBLICK
AUF
WEITERE
UNTERSUCHUNGEN
-------------------------------------------------------------
9
5
ZUSAMMENFASSUNG
-------------------------------------------------------------------------------------
10
J
6
SUMMARY
----------------------------------------------------------------------------------------------------
10
7
LITERATUR
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
10
8
ANHANG
------------------------------------------------------------------------------------------------------
111
8.1
SEQUENZ
DES
5
'
-BEREICHES
DES
T.
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERONS
-----------------
111
8.2
KODONVERWENDUNG
IM
T.
THERMOPHILUS
NUSALINFB-OPERON
-------------------------------
121
8.3
VERGLEICH
DER
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
------------------------------------------------
12
9
ERKLAERUNG
---------------------------------------------------------------------------------------------------
12:
10
DANKSAGUNG
---------------------------------------------------------------------------------------------
121 |
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