Regulatorische Mechanismen der gerichteten Migration humaner dermaler und epidermaler Zellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 1
I EINLEITUNG 2
1.1 ROLLO DER ZELLULAEREN MIGRATION IN KOMPLEXEN ORGANISMEN 2
1.2 BEDEUTUNG DER ZELLMIGRATION FUER DAS DERMALE BINDEGEWEBE 3
1.2.1 AUFBAU UND FUNKTION DES DERMALEN BINDEGEWEBES 3
1.2.2 DIE ZELLMIGRATION IM KONTEXT DER KUTANEN WUNDHEILUNG 6
1.2.3 CHARAKTERISTIKA DER MATRIXPROTEINE KOLLAGEN TYP I, LAMININ UND
FIBRONEK-
TIN - EINFLUSS AUF DIE ZELLULAERE MIGRATION IN-VITRO 7
1.3 DIE INTEGRINE - ZELLOBERFLAECHENREZEPTOREN FUER MATRIXPROTEINE 10
1.3.1 ADHAESIONSMOLEKUELE - MEDIATOREN VON ZELL-ZELL UND ZELL-MATRIX
INTERAK
TIONEN 10
1.3.2 STRUKTUR UND FUNKTION DER INTEGRINE 11
1.4 BEDEUTUNG DER MATRIX-METALLOPROTEINASEN BEI DER GEWEBEREMODELL-
LIERUNG 18
1.5 REGULATION DER ZELLULAEREN MIGRATION 21
1.5.1 DIE MORPHOLOGIE MOTILER ZELLEN 21
1.5.2 DIE ZELLMIGRATION - EXPERIMENTELLE MOEGLICHKEITEN ZUR ANALYSE IHRER
REGU
LATION 22
1.5.3 ZIELSETZUNG 24
II MATERIAL UND METHODEN 26
11.1 MATERIAL 26
11.1.1 CHEMIKALIEN UND RADIOCHEMIKALIEN 26
11.1.2 ZELLKULTURMEDIEN UND DEREN ZUSAETZE 26
11.1.3 PUFFERLOESUNGEN 27
11.1.4 PROTEINE, ENZYME 27
11.1.5 MOLEKULARGEWICHTSMARKER 28
11.1.6 ANTIKOERPER 29
11.1.7 BAKTERIEN UND PLASMIDE 30
11.1.8 DIGONUKLEOTIDE 30
11.2 METHODEN DER ZELLKULTUR 31
11.2.1 ALLGEMEINE KULTURBEDINGUNGEN 31
11.2.2 BESTIMMUNG DER ZEITZAHL 32
I I.2.3 ETABLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON HUMANEN DERMALEN FIBROBLASTEN
UND
KERATINOZYTEN 32
II.2.4 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 33
11.3 FLUORESZENZ-ZYTOMETRIE (FACS) 33
11.4 ADHAESIONSTEST ZUM NACHWEIS VON ZELL-MATRIX BINDUNGEN 34
11.4.1 DER STANDARDISIERTE ADHAESIONSTEST 34
11.4.2 HEMMUNG DER ZELL-MATRIX ADHAESION DURCH SS
1 INTEGRIN ANTIKOERPER 36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
11.5 BESTIMMUNG DER MIGRATION 36
11.5.1 MODIFIZIERTER BOYDENKAMMER MIGRATIONSTEST 36
11.5.2 HEMMUNG DER ZELIMIGRATION DURCH BLOCKIERUNG DER INTEGRIN-MATRIX
BIN
DUNG 37
11.5.3 HEMMUNG DER ZELIMIGRATION DURCH BLOCKIERUNG DER
MATRIX-METALLOPRO-
TEINASE AKTIVITAET 38
11.6 PRAEPARATION UND ANALYSE VON DNA 38
11.6.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 38
11.6.2 RESTRIKTION VON DNA 39
11.6.3 PRAEZIPITATION VON DNA 39
11.6.4 AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA 39
11.6.5 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN 39
11.6.6 LIGATION LINEARISIERTER DNA 40
11.6.7 TRANSFORMATION VON
ESCHERICHIA COLI ZELLEN 41
11.6.8 ISOLIERUNG REKOMBINANTER PLASMID DNA FUER ANALYTISCHE ZWECKE 41
11.6.9 ISOLIERUNG REKOMBINANTER PLASMID DNA IN PRAEPARATIVEN MENGEN 41
11.7 STABILE TRANSFEKTION UND KLONIERUNG VON HACAT ZEILEN 42
11.7.1 STABILE TRANSFEKTION VON HACAT ZELLEN 42
11.7.2 KLONIERUNG VON HACAT ZEILEN 42
11.8 RNA ANALYSE 43
11.8.1 PRAEPARATION VON RNA AUS ZELLKULTUREN 43
11.8.2 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON RNA 43
11.8.3 REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA IN CDNA 43
11.8.4 SPEZIFISCHE AMPLIFIKATION VON CDNA SEQUENZEN DURCH DIE POLYMERASE
KETTENREAKTION (PCR) 44
11.9 METHODIK DER IMMUNPRAEZIPITATION 45
11.9.1 MARKIERUNG VON ZELLEN MITTELS
35S-METHIONIN 45
11.9.2 PRAEPARATION VON ZELLYSATEN 45
11.9.3 PRAEPARATION VON GLYKOPROTEINEN AUS ZELLYSATEN 45
11.9.4 IMMUNPRAEZIPITATION VON INTEGRINEN AUS GLYKOPROTEINFRAKTIONEN 46
11.9.5 IMMUNPRAEZIPITATION DER MMP-1 AUS ZELLUEBERSTAENDEN 46
11.9.6 SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 46
11.9.7 DENSITOMETRISCHE MESSUNG VON AUTORADIOGRAMMEN 47
11.10 METHODIK DER IMMUNFLUORESZENZ ZUM NACHWEIS VON MMP-1 47
11.11 GIEMSA FAERBUNG 48
III ERGEBNISSE 49
111.1 EXPRESSION VON SS
1 INTEGRINEN AUF DER ZELLOBERFLAECHE VON PRIMAEREN
DERMALEN FIBROBLASTEN UND KERATINOZYTEN IN-VITRO 49
111.2 EINFLUSS VON MG
24 UND CA2+ AUF DIE SST INTEGRIN-VERMITTELTE INTER
AKTION VON DERMALEN FIBROBLASTEN UND KERATINOZYTEN MIT KOLLAGEN,
FIBRONEKTIN UND LAMLNIN 51
111.2.1 HEMMUNG DER ZELL-MATRIX ADHAESION DURCH 8
1 INTEGRIN ANTIKOERPER 51
INHALTSVERZEICHNIS
111.2.2 EINFLUSS VON MG
2* UND CA2+ AUF DIE ADHAESION VON KERATINOZYTEN UND
FIBROBLASTEN AN VERSCHIEDENE MATRIXPROTEINE 54
111.2.3 EXPRESSION VON SS
T INTEGRINEN IN ABHAENGIGKEIT DER MG2* UND CA2+ KON
ZENTRATION 59
111.2.4 HEMMUNG DER ZELLMIGRATION DURCH ANTIKOERPER GEGEN SS
T INTEGRINE 61
111.2.5 EINFLUSS VON MG
2* UND CA2* AUF DIE DURCH KOLLAGEN, FIBRONEKTIN UND
LAMININ INDUZIERTE MIGRATION VON KERATINOZYTEN 63
LLI.3 MIGRATION DER KERATINOZYTEN ZELLINIE HACAT NACH KONSTITUTIVER
EXPRESSION VON SST INTEGRIN ANTISENSE RNA 66
111.3.1 KLONIERUNG VON SS
T INTEGRIN CDNA IN DEN EXPRESSIONSVEKTOR PRC 67
111.3.2 STABILE TRANSFEKTION VON HACAT ZELLEN MIT DEM KONSTRUKT PRC/SS,
AS 70
111.3.3 NACHWEIS DER SS
1 INTEGRIN ANTISENSE RNA IN TRANSFIZIERTEN HACAT ZELLEN 71
111.3.4 INHIBITION DER SS
1 INTEGRINSYNTHESE IN TRANSFIZIERTEN HACAT ZELLEN 73
111.3.5 INTEGRINEXPRESSION IN HACAT ZELLEN NACH HEMMUNG DER SS
1 INTEGRINSYN
THESE 74
111.3.6 MIGRATION VON SS
1 INTEGRIN-DEPLETIERTEN HACAT ZELLEN 75
III.4 DIE ROLLE DER MATRIX-METALLOPROTEINASE-1 BEI DER DURCH KOLLAGEN
INDUZIERTEN MIGRATION VON FIBROBLASTEN 78
111.4.1 HEMMUNG DER FIBROBLASTENMIGRATION DURCH DIE
METALLOPROTEINASE-INHIBI-
TOREN
A 2-MAKROGLOBULIN, GALARDIN UND TIMP-1 78
111.4.2 HEMMUNG DER MMP-1 SYNTHESE DURCH ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE 82
HL.4.4 MIGRATION VON FIBROBLASTEN NACH INHIBITION DER MMP-1 SYNTHESE 83
ILL.4.5 LOKALISATION DER MMP-1 IN MIGRIERENDEN FIBROBLASTEN 85
IV DISKUSSION 88
IV.1. DER BOYDENKAMMER-TEST ALS METHODE ZUR ANALYSE DER ZELLMIGRA
TION 89
IV.2 REGULATION DER INTEGRIN-VERMITTELTEN ZELL-MATRIX WECHSELWIRKUNGEN
DURCH DIVALENTE KATIONEN ("QUALITATIVE REGULATION") 91
IV.3 REGULATION DER ZELLMIGRATION DURCH QUANTITATIVE VERAENDERUNGEN IN
DER SS1 INTEGRINEXPRESSION ("QUANTITATIVE REGULATION") 100
IV.4 REGULATION DER SS
T INTEGRIN-VERMITTELTEN ZEILWANDERUNG IM BINDE
GEWEBE DURCH MATRIX-METALLOPROTEINASEN 105
IV.5 MODELL DER GERICHTETEN ZELLMIGRATION 110
V ZUSAMMENFASSUNG 114
VI LITERATURVERZEICHNIS 115
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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