Translationskontrolle während der Spermatogenese von Drosophila melanogaster: Untersuchungen zu Protein-RNA-Wechselwirkungen
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
IV
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
12
2.1
LOESUNGEN
UND
CHEMIKALIEN
12
2.1.1
MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS
12
2.1.2
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
12
2.2
GERAETE
14
2.3
FLIEGENZUCHI
15
2.3.1
UMGANG
MIT
DEN
FLIEGEN
15
2.3.2
DROSOPHILA-STAEMME
15
2.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN
15
2.4.1
BAKTERIENSTAEMME
15
2.4.2
VEKTOREN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
16
2.4.3
KLONE
16
2.4.4
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
16
2.4.5
PLASMIDSCHNELLPRAEPARATION
17
2.4.6
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UEBER
ADSORPTION
AN
DEAE-NA45
MEMBRAN
18
2.4.7
KLENOW-REAKTION
19
2.4.8
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
19
2.4.9
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
2.4.10.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COH'-DH5A
ZELLEN
20
2.4.10.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/R-BMH71-18-ZELLEN
21
2.4.11.1
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/7-ZELLEN
21
2.4.11.2
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/F-BMH71-18-ZELLEN
MIT
RF-DNA
VON
M13-PHAGEN
21
2.4.12
SEQUENZIERUNG
22
2.5
GELELEKTROPHORESE
SYSTEME
22
2.5.1
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
23
2.5.2
NICHT-DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
24
2.5.3
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
25
2.6
NACHWEIS
VON
NUKLEINSAEUREN
27
2.6.1
UV-'SHADOWING'
27
2.6.2
SILBERFAERBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
IM
PAA-GEL
28
2.7
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
28
2.7.1
COOMASSIE-FAERBUNG
28
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.2
CUCL
2-FAERBUNG
29
2.7.3
PONCEAU
ROT-FAERBUNG
29
2.7.4
AMIDOSCHWARZ-FAERBUNG
29
2.8
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
30
2.8.1
RADIOAKTIV
MARKIERTE
IN
VITRO-TRANSKRIPTE
30
2.8.2
SYNTHESE
VON
BR-URIDIN
SUBSTITUIERTEN
TRANSKRIPTEN
31
2.8.3
AUFREINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
31
2.8.4
ELUTION
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
PAA-GELEN
31
2.8.5
AUFREINIGUNG
UEBER
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
32
2.9
'ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
ASSAY"
33
2.9.1
ZYTOPLASMATISCHE
PROTEINEXTRAKTE
AUS
DROSOPHILA
MELANOGASTER
TESTISGEWEBE
33
2.9.2
PROTEIN-NUKLEINSAEURE-KOMPLEXE,
BINDUNGSREAKTION
34
2.9.3
AUFTRENNUNG
VON
PROTEIN-NUKLEINSAEURE-KOMPLEXEN
35
2.9.4
'CROSSLINK'
VON
PROTEIN-NUKLEINSAEURE-KOMPLEXEN
35
2.10
AUFREINIGUNG
VON
BINDUNGSPROTEINEN
36
2.10.1
PRAEPARATIVE
BINDUNGSREAKTION
UND
AUFTRENNUNG
36
2.10.2
SDS-PAGE
37
2.10.3
ELEKTROELUTION
DER
PROTEINE
37
2.11
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
38
2.11.1
PROBENVORBEREITUNG
38
2.11.2
VORBEREITUNG
DER
ROEHRCHENGELE
39
2.11.3
AUSWERTUNG
DER
FOKUSGELE
40
3.
ERGEBNISSE
41
3.1
'ELECTROPHORETIC
MOBILITY
SHIFT
8888/
41
3.1.1
EMSA
MIT
DEM
-5/+47-IN
WTRO-TRANSKRIPT
46
3.1.2
FUER
DIE
KOMPLEXBILDUNG
WERDEN
PROTEINFAKTOREN
BENOETIGT
49
3.1.3
SPEZIFITAET
DER
KOMPLEXBILDUNG
MIT
DEM
-5/+47-TRANSKRIPT
49
3.1.4
VERSCHIEDENE
KOMPLEXE
MIT
DEM
-5/+47-TRANSKRIPT
52
3.1.5
KOMPETITION
DES
-5/+47-'BANDSHIFTS'
MIT
EINER
DNA-PROBE
52
3.1.6
EMSA
MIT
DEM
+20/+47-TRANSKRIPT
56
3.1.7
EMSA
MIT
DEM
GEM-TCE-TRANSKRIPT
59
3.1.8
NUKLEOTID-AUSTAUSCH
IM
TCE
61
3.1.9
EMSA
MIT
LARVALEM
TESTISPROTEIN
67
3.1.10
EMSA
MIT
PROTEINLYSATEN
AUS
ANDEREN
DROSOPHILA
MELANOGASTER
GEWEBEN
69
3.1.11
EMSA
MIT
TESTISPROTEIN
AUS
ANDEREN
DROSOPHILA-SPEZIES
71
3.2
'CROSSLINK'-EXPERIMENTE
71
3.2.1
'CROSSLINK'
VON
TESTISPROTEIN
MIT
IN
WTRO-TRANSKRIPTEN
71
3.2.2
'CROSSLINK'-EXPERIMENT
MIT
DEM
-5/+47-TRANSKRIPT
UND
ADULTEM
TESTISPROTEINLYSAT
73
3.2.3
'CROSSLINK'-EXPERIMENT
MIT
DEM
GEM-TCE-TRANSKRIPT
UND
ADULTEM
TESTISPROTEINLYSAT
74
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2.4
'CROSSLINK'-EXPERIMENT
MIT
LARVALEM
TESTISPROTEINLYSAT
74
3.2.5
SPEZIFITAET
DER
QUERVERNETZTEN
KOMPLEXE
FUER
MST8
7F-SQUENZEN
77
3.2.6
'CROSSLINK'-EXPERIMENTE
MIT
DEN
MUT2
UND
MUT3-TRANSKRIPTEN
78
3.2.7
'CROSSLINK'-EXPERIMENT
MIT
TESTISPROTEIN
AUS
ANDEREN
DROSOPHILA
SPEZIES
80
3.3
ISOLIERUNG
DER
KOMPLEXPROTEINE
82
3.3.1
DIE
PROTEINE
AUS
DEM
-5/+47-KOMPLEX
84
3.4
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
86
3.5
EMSA
MIT
TESTISPROTEIN
AUS
DROSOPHILA
MELANOGASTER-STAEMMETL
DER
MUTANTEN
RB97D
2
UND
HRBSTF
1
86
4.
DISKUSSION
89
4.1
PROTEIN-NUKLEINSAEURE-KOMPLEXE
MIT
MST87F-IN
RFTRO-TRANSKRIPTEN
90
4.2
EIN
BINDUNGSFAKTOR,
DER
SPEZIFISCH
AN
DAS
TRANSLATIONS-KONTROLL
ELEMENT
BINDET
92
4.3
DIE
AUSBILDUNG
EINES
MULTIPROTEINKOMPLEXES
95
4.4
DIE
POSITION
DES
TCE
IM
5'-NICHT
TRANSLATIERTEN
BEREICH
98
4.5
DAS
TCE
IN
DER
TRANSKRIPTIONSREGULATION
101
4.6
DIE
KONSERVIERUNG
DER
BINDUNGSFAKTOREN
IN
ANDEREN
DROSOPHILA
SPEZIES
101
4.7
AUSBLICK
102
5.
ZUSAMMENFASSUNG
104
6.
LITERATUR
105
7.
ANMERKUNGEN
114 |
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