Molekularbiologische Untersuchungen zur 5-Ketoglukonatbildung bei Gluconobacter oxydans:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbiliothek
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
I.
EINLEITUNG
1
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
7
1.
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
7
2.
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
8
3.
NAEHRMEDIEN
UND
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
9
4.
BESTIMMUNG
DES
BAKTERIENWACHSTUMS
11
5.
ZELLEMTE
UND
ZELLAUFSCHLUSSMETHODEN
12
5.1
ZELLEMTE
12
5.2
ZELLAUFSCHLUSS
12
5.3
ZELLEXTRAKTION
MIT
PERCHLORSAEURE
13
6.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
SUBSTRATEN
UND
PRODUKTEN
13
6.1
HPLC-BESTIMMUNG
VON
ORGANISCHEN
SAEUREN
13
6.2
HPLC-BESTIMMUNG
VON
ZUCKERN
14
6.3
ENZYMATISCHE
BESTIMMUNG
VON
NIKOTINAMID
ADENINDINUKLEOTIDEN
15
7.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
UND
PROTEINKONZENTRATIONEN
16
7.1
BESTIMMUNG
DER
5-KETOGLUKONAT
REDUZIERENDEN
AKTIVITAETEN
16
7.2
BESTIMMUNG
DER
GLUKONAT
OXIDIERENDEN
AKTIVITAETEN
16
7.3
BESTIMMUNG
DER
NADPH-OXIDASE-AKTIVITAET
17
7.4
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAETEN
IM
ELEKTROPHORESEGEL
17
7.5
PROTEINBESTIMMUNG
17
8.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
MAKROMOLEKUELEN
18
8.1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
18
8.2
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
19
9.
ISOLIERUNG
VON
ENZYMEN
19
9.1
ISOLIERUNG
DER
POLYOL:
NADP
+
-5-OXIDOREDUKTASE
AUS
G.
OXYDANS
19
9.2
ISOLIERUNG
DER
GLUKONAT:
NADP*-5-OXIDOREDUKTASE
AUS
G.
OXYDANS
20
9.3
ISOLIERUNG
REKOMBINANTER
GLUKONAT:
NADPM-OXIDOREDUKTASE
AUS
E
COLI
21
10.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ENZYME
22
10.1
BESTIMMUNG
DER
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTE
22
10.2
BESTIMMUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
23
10.3
AMINOTERMINALE
SEQUENZIERUNG
24
11.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
POLYOL:
NADP
+
-5-OXIDOREDUKTASE
24
12.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
25
12.1
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
G.
OXYDANS
UND
E.
COLI
25
12.2
REKOMBINANTE
DNA-TECHNIKEN
26
12.3
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
28
12.4
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
UND
AMPLIFIKATION
VON
DNA
DURCH
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
28
12.5
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
SANGER
MIT
DEM
A.L.F.
DNA-SEQUENCER
UND
SEQUENZANALYSE
29
12.6
DNA-MARKIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN
30
12.7
DNA-DNA
HYBRIDISIERUNG
30
12.8
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
31
12.9
FILTERKREUZUNG
VON
E.
COLI
UND
G.
OXYDANS
31
12.10
PLASMIDSTABILITAETSTEST
32
HL
ERGEBNISSE
33
1.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
POLYOL:
NADP
+
-5-OXIDOREDUKTASE
AUS
G.
OXYDANS
33
1.1
ISOLIERUNG
DER
POLYOL:
NADP*-5-OXIDOREDUKTASE
33
1.2
CHARAKTERISIERUNG DER
POLYOL:
NADP
+
-5-OXIDOREDUKTASE
35
1.3
AMINOTERMINALE
SEQUENZIERUNG
DER
POLYOL:
NADP*-5-OXIDOREDUKTASE
UND
HERSTELLUNG
EINER
GENSONDE
FUER
DAS
POR-GCA
41
1.4
VORKOMMEN
DER
POLYOL:
NADP^-5-OXIDOREDUKTASE
INNERHALB
DER
SPEZIES
GLUCONOBACTER
44
2.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
GLUKONAT:
NADP
+
-5-OXIDOREDUKTASE
AUS
G.
OXYDANS
45
2.1
ISOLIERUNG
DER
GLUKONAT:
NADP
4
-5-OXIDOREDUKTASE
45
2.2
CHARAKTERISIERUNG DER
GLUKONAT:
NADP^-S-OXIDOREDUKTASE
48
2.3
AMINOTERMINALE
SEQUENZIERUNG
DER
GLUKONAT:
NADP+-5-OXIDOREDUKTASE
UND
HERSTELLUNG
EINER
GENSONDE
FUER
DAS
GNO-GCA
52
3.
KLONIERUNG
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
GWO-GENS
54
3.1
ERSTELLUNG
EINER
RESTRIKTIONSKARTE
DES
GNO-GENS
55
3.2
KLONIERUNG
DES
GNO-GENS
55
3.3
SEQUENZIERUNG
DES
GNO-GENS
57
3.4
SEQUENZVERGLEICHE
MIT
ANDEREN
OXIDOREDUKTASEN
60
3.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
GLUKONAT:
NADP^-5-OXIDOREDUKTASE
AUS
E
COLI
62
4.
EXPRESSION
DES
GNO-GENS
IN
G.
OXYDANS
65
4.1
ETABLIERUNG
EINES
GENTRANSFERSYSTEMS
FUER
G.
OXYDANS
65
4.2
EXPRESSION
DES
GNO-GENS
IN
G.
OXYDANS
67
5.
EXPRESSION
DES
GENS
FUER
DIE
NADPH-OXIDASE
AUS
SACCHAROMYCES
CARLSBERGENSIS
IN
G.
OXYDANS
71
6.
CHARAKTERISIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
G.
OXYDANS-SXAEMME
75
6.1
5-KETOGLUKONATPRODUKTIVITAET
DER
REKOMBINANTEN
STAEMME
75
6.2
BESTIMMUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
5-KETOGLUKONATGEHALTES
77
6.3
BESTIMMUNG
DER
NADP
+
/NADPH-VERHAELTNISSE
78
IV.
DISKUSSION
79
V.
ZUSAMMENFASSUNG
90
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
91 |
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