Untersuchungen zu Mutationen in den Genen der Apolipoproteine E und B: Beziehung zwischen Genotyp und Phänotyp
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS - NI YY
INHALTSVERZEICHNIS
1. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VI
2. ZUSAMMENFASSUNG
1
3. EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 3
3.1 EINLEITUNG 3
3.1.1. STRUKTUR UND FUNKTION DER APOLIPOPROTEINE B UND E 3
3.1.2. ROLLE DER APOLIPOPROTEINE B UND E IM UPOPROTEINSTOFFWECHSEL 4
3.1.3. DEFEKTE IN APO E UND APO B-100 ALS URSACHE VON
LIPKJSTOFFWECHSELSTOERUNGEN 5
3.1.3.1. DEFEKTE IM APO E- GEN 5
3.1.3.2. DEFEKT IM GEN DES APO B-100 9
3.2 PROBLEMSTELLUNG 10
4. ERGEBNISSE
11
4.1. ANALYSE EINES NULLALLELS DES APOLIPOPROTEIN E - GENS 11
4.1.1. KLONIERUNGSSTRATEGIE
11
4.1.1.1. BESTIMMUNG GEEIGNETER RESTRIKTIONSENZYME FUER EINE KLONIERUNG
DES APO E - GENS NACH FRAGMENT-ANREICHERUNG 12
4.1.1.2. MONIERUNG DES APO E - GENS ALS BEL I - FRAGMENT AUS GENOMISCHER
DNA 16
4.1.1.3. HERSTELLUNG VON SUBKLONEN FUER SEQUENZIERUNGEN 19
4.1.2. SEQUENZIERUNG 23
4.1.3. BESTIMMUNG DES URSAECHLICHEN DEFEKTS IM NULLALLEL 26
4.1.3.1. BESTAETIGUNG DER MUTATIONEN IM NICHTKODIERENDEN BEREICH ALS
KUENSTLICHE
RESTRIKTIONSFRAGMENTLAENGENPOLYMORPHISMEN (CREATED RFLPS) ODER DURCH
ALLELSPEZIFISCHE OLIGONUKLEOTIDE 26
4.1.3.2. NACHWEIS DER FRAMESHIFT-MUTATION (MUTATION NR. 6) 39
4.1.4. IN VITRO-EXPRESSION DES MUTANTEN ALLELS 42
4.1
.4.1. HILFSMITTEL ZUR KONSTRUKTION UND MANIPULATION REKOMBINANTER
PLASMIDE 42
4.1.4.1.1. DAS PMA/C 5-8 SYSTEM ZUR IN VITRO - MUTAGENESE NACH DER
"GAPPED DUPLEX* METHODE 42
4.1.4.1.2. DER VEKTOR P4DFOK ALS KONSTRUKTIONSHILFSMITTEL 45
4.1.4.2. INSERTKONSTRUKTION:
MANIPULATIONEN AN DEN EXONS 3 UND 4 DES APO E - GENS 48
4.1.4.2.1. KONSTRUKTION DER CDNA FUER DEN BEREICH VOM START BIS INS 4.
EXON 49
4.1.4.2.2. ERZEUGUNG DES POLY-A-SCHWANZES 51
4.1.4.2.3. REKOMBINATION ZUR GESAMT-CDNA 54
4.1.4.3. IN VITRO - TRANSKRIPTION UND TRANSLATION 55
4.1.4.4. ANALYSE DER THROMBINSPALTPRODUKTE DES IN VITRO -
TRANSLATIONSPRODUKTS 56
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
-IV-
4.1.5. UNTERSUCHUNG DER APO E - MRNA AUS MONOZYTEN-MAKROPHAGEN 57
4.1.6. OBERBLICK UND ERGINZUNG DER IM RAHMEN DER ANALYSE DES NULLALLELS
ERZIELTEN ERGEBNISSE 62
4.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR R3500Q - VARIANTE DES APOLIPOPROTEIN B-100 MIT
HILFE
DER MUTAGENICALLY SEPARATED POLYMERASE CHAIN REACTION (MS-PCR) 64
4.2.1. ANALYSE VON EINZELPROBEN MIT HILFE DER MS-PCR 64
4.2.2. ANALYSE VON GEPOOLTEN PROBEN 67
4.2.3. ANALYSE VON MS-PCR-PRODUKTEN AUF FESTPHASENSYSTEMEN,
AUTOMATISIERUNG 69
5. DISKUSSION 73
6. FUNKTIONSBESCHREIBUNG VON EIGENEN PROGRAMMEN 80
6.1.
MARKER.BAT: BESTIMMUNG VON DNA-FRAGMENTLAENGEN IN AGAROSEGELEN 80
6.2. PROGRAMM ZUR STEUERUNG DES TECAN RSP-5052 PIPETTIERROBOTERS 81
7. METHODEN 83
7.1. SYNTHESE UND REINIGUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN 83
7.2. ISOLATION UND REINIGUNG GENOMISCHER DNA 85
7.2.1. ISOLATION VON GENOMISCHER DNA AUS HUMANBLUT (MIT REINIGUNG) 85
7.2.1.1. GEWINNUNG VON LEUKOZYTEN AUS EDTA-BL UT 85
7.2.1.2. PRAEPARATION VON DNA AUS LEUKOZYTEN 86
7.2.1.3. BESTIMMUNG VON KONZENTRATION UND REINHEIT DER DNA 87
7.2.2. SCHNELLISOLATION GENOMISCHER DNA 87
7.3. ANAYLSE GENOMISCHER DNA MIT HILFE DER SOUTHERNBLOT-TECHNIK 88
7.3.1. SOUTHERNBLOT 88
7.3.3. MARKIERUNG EINER CDNA MIT
32P 88
7.3.4. NACHWEIS VON DNA-FRAGMENTEN NACH SOUTHERNBLOT DURCH
HYBRIDISATION MIT MARKIERTER CDNA 90
7.3.5. MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT
32P 91
7.3.6. NACHWEIS VON DNA-FRAGMENTEN NACH SOUTHERNBLOT DURCH
HYBRIDISATION MIT EINEM MARKIERTEN OLIGONUKLEOTID 91
7.4. KLONIERUNG IN
X
47.1 93
7.4.1. LIGATION UND IN VITRO - VERPACKUNG VON
X
47.1 - DNA 93
7.4.2. PLATTIERUNG DER PHAGEN NACH IN VITRO - VERPACKUNG 93
7.4.3. ANZUCHT DER PHAGEN UND ISOLATION DES VEKTORS
X
47.1 94
7.4.4. PRAEPARATION VON VEKTORARMEN 95
7.4.5. PRAEPARATION DES BEL I - INSERTS VON G.N. UND KLONIERUNG IN
X
47,1 95
7.4.6. PLAQUE-LIFTING UND SCREENING 96
INHALTSVERZEICHNIS . V YY
7.5. KLONIERUNG IN PLASMIDEN, ML3-SYSTEMEN UND PHAGEMIDEN 97
7.5.1. UGATION VON KOMPATIBLEN RESTRIKTIONSFRAGMENTEN 97
7.5.2. UEBERFUEHRUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENT-ENDEN IN 'WUNF-ENDEN 98
7.5.3. UGATION VON "BIUNT'-ENDEN 98
7.5.4. UGATION VON OLIGONUKLEOTIDEN IN PLASMIDE 99
7.5.4.1. UGATION EINES ECOR V-UNKERS IN P4DFOK 99
7.5.4.2. UGATION DES OLLGONUKLEOTKJS POLY-A-ON IN P4DFOK 99
7.5.5. VERKNUEPFUNG MIT HILFE VON KOMPLEMENTAEREN HOMOPOLYMER-SCHWAENZEN 99
7.6. TRANSFORMATION VON E. COII MIT PLASMIDEN 101
7.7. PLASMIDISOLATION 102
7.7.1. MINI-PLASMIDISOLATION 103
7.7.2. PRAEPARATIVE PLASMIDISOLATION 104
7.8. ISOLIERUNG EINZELSTRAENGIGER DNA AUS PHAGEMIDEN 105
7.9. DNA-SEQUENZIERUNG NACH SAENGER 106
7.10. PCR-TECHNIKEN 109
7.11. IN VITRO MUTAGENESE NACH DER "GAPPED DUPLEX" METHODE 110
7.12. IN VITRO TRANSKRIPTION UND TRANSLATION 113
7.12.1. IN VITRO TRANSKRIPTION 113
7.12.2. IN VITRO TRANSLATION 114
7.13. ANALYSE VON IN VITRO TRANSLATIONSPRODUKTEN IM SDS-GEL 114
7.13.1. SDS-GEIELEKTROPHORESE 114
7.13.2. THROMBINSPALTUNG 116
7.14. ZELLKULTUR - TECHNIKEN 117
7.15. ANALYSE DER APO E-EXPRESSION IN MONOZYTEN-MAKROPHAGEN 118
7.15.1. ISOLATIONDER RNA AUS KULTIVIERTEN MONOZYTEN-MAKROPHAGEN 118
7.15.2. ANALYSE DER RNA MIT HILFE DER REVERSEN TRANSKRIPTION,
PCR UND RESTRIKTIONSSPALTUNG 119
8. GERAETE UND REAGENZIEN 122
8.1. GERAETE 122
8.2. REAGENZIEN 124
9. LITERATURVERZEICHNIS 127 |
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