Synthese, Immobilisierung und Einsatz biotinylierter Peptidantigene zur Bestimmung von Antikörpern gegen das M-Protein von Streptococcus pyogenes:
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INHALTSVERZEICHNIS
VII
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
/
SUMMARY
.
I
ABKUERZUNGEN
.
V
INHALTSVERZEICHNIS
.
VII
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
DIE
BEDEUTUNG
VON
STREPTOCOCCUS
PYOGENES
IN
DER
HUMANMEDIZIN
.
1
1.2.
DAS
M-PROTEIN
DER
STREPTOKOKKEN
.
4
1.3.
BISHERIGE
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
ANTI-M-PROTEIN
ANTIKOERPERN
.
9
1.4.
SYNTHETISCHE
PEPTIDANTIGENE
IM
IMMUNOASSAY
-
DARSTELLUNG
UND
EINSATZ
.
11
1.5.
IMMOBILISIERUNG
VON
NIEDERMOLEKULAREM
ANTIGEN:
SIMULIERUNG
BIOLOGISCHER
STRUKTUREN
AUF
MIKROTITERPLATTEN
MIT
HILFE
VON
OBERFLAECHENGEBUNDENEM
(STREPT-)AVIDIN
.
12
1.6.
DIE
BESTIMMUNG
VON
(STREPT-)AVIDINBINDUNGSSTELLEN
AN
FESTEN
TRAEGEM
.
16
2.
PROBLEMSTELLUNG
.
20
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
22
3.1.
SYNTHESE
DER
BIOTLNYLIERTEN
PEPTIDE
.
22
3.1.1.
PEPTIDSYNTHESE
.
22
3.1.2.
REINIGUNG
DER
PEPTIDE
.
25
3.1.3.
ANALYSE
DER
PEPTIDE
.
26
3.2.
ENTWICKLUNG
EINES
RADIOAKTIVEN
TRACERSYSTEMS
AUF
DER
BASIS
EINES
L25
IOD-MARKIERTEN
BIOTINDERIVATS
.
27
3.2.1.
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
5-IODHISTAMIN
(MIH)
.
27
VIII
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIOTINYL-N-HYDROXYSUCCINIMIDESTER
(BNHS)
SOWIE
UNTERSUCHUNG
DES
HYDROLYSEVERHALTENS
.
28
3.2.3.
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIOTINYL-5-MONOIODOHISTAMIN
(BMIH)
.
29
3.2.4.
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIOTINYLHISTAMIN
(BH)
.
30
3.2.5.
SPEKTROPHOTOMETRISCHE
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
BMIH
UND
BH
.
30
3.2.6.
DARSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
BIOTINYL-5
125
IODOHISTIDIN
(BM
125
IHIS)
.
31
3.2.7.
OPTIMIERUNG
DES
MOLAREN
REAKTIONSVERHAELTNISSES
BNHS/HISTAMIN
FUER
DIE
DARSTELLUNG
VON
BM
125
IH
.
32
3.2.8.
HPLC-TRENNUNG
VON
BIOTIN,
BIOTINYLHISTAMIN
UND
BIOTINYLMONOIODOHISTAMIN
BEI
PH
2,2
UND
PH
6,0
.
32
3.2.9.
VORREINIGUNG
DES
RADIOIODIERUNGSANSATZES
UEBER
SEP-PAK-C
18
-EINWEGKARTUSCHEN
-
VORVERSUCH
ZUR
ERMITTLUNG
DES
REINIGUNGSFAKTORS
.
33
3.2.10.
DARSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
BIOTINYL-5
125
IODOHISTAMIN
.
33
3.2.11.
ANBINDUNGSTEST
VON
BM
125
IH
AN
STREPTAVIDINAGAROSE
BZW.
STREPTAVIDIN-BESCHICHTETE
DYNABEADS
.
34
3.3.
IMMOBILISIERUNG
VON
AVIDIN
UND
STREPTAVIDIN
AN
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
UND
BINDUNG
DER
BIOTINY
LIERTEN
PEPTIDE
.
35
3.3.1.
BESCHICHTUNG
VON
MIKROTITERPLATTEN
MIT
(STREPT-)AVIDIN
UND
EINSATZ
DES
TRACERSYSTEMS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
BINDUNGSSTELLEN
FUER
BIOTIN
.
35
3.3.2.
UNTERSUCHUNG
DER
OBERFLAECHENSTABILITAET
VON
KOMPLEXIERTEM
UND
NICHT
KOMPLEXIERTEM
AVIDIN
UNTER
VERSCHIEDENEN
LAGERUNGSBEDINGUNGEN
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
IX
3.3.3.
STABILITAET
DES
AVIDIN/BIOTINYLPEPTIDKOMPLEXES
AN
DER
OBERFLAECHE
WAEHREND
DES
IMMUNOASSAYS
.
37
3.3.4.
ABSAETTIGUNG
DER
BINDUNGSSTELLEN
DES
OBERFLAECHEN
IMMOBILISIERTEN
AVIDINS
MIT
DEN
BIOTINYLPEPTIDEN
-
BESTIMMUNG
DER
OPTIMALEN
PEPTIDKONZENTRATION
.
38
3.3.5.
VERGLEICH
DER
BESCHICHTUNG
MIT
AVIDIN
UND
AVIDIN/PEPTIDKOMPLEX
.
38
3.4.
IMMUNOASSAY
.
39
3.4.1.
VERFAHRENSABLAUF
DES
ELISA
ZUR
BESTIMMUNG
VON
ANTI
M-PROTEIN-ANTIKOERPEM
IN
KANINCHENHYPERIMMUNSEREN
.
39
3.4.2.
ABSORPTION
VON
ANTI-AVIDIN-ANTIKOERPEM
AUS
KANINCHEN
HYPERIMMUNSERUM
.
40
3.4.3.
ELISA
NACH
BESCHICHTUNG
MIT
AVIDIN/BIOTINYL
PEPTIDKOMPLEX
.
40
3.4.4.
DIREKTE
BESCHICHTUNG
MIT
DEN
BIOTINYLPEPTIDEN
UND
VERGLEICH
MIT
DEM
AVIDINVERFAHREN
.
40
3.4.5.
KOMPLEXIERUNG
DER
ANTIKOERPER
DURCH
VORINKUBATION
DER
SERUMVERDUENNUNGEN
MIT
HOMOLOGEN
PEPTIDEN
.
41
3.4.6.
LAGERUNGSVERSUCH
UND
REGENERIERUNG
BESCHICHTETER
MIKROTITERPLATTEN
.
41
3.4.7.
VERFAHRENSABLAUF
DES
ELISA
MIT
HUMANSEREN
.
42
4.
ERGEBNISSE
.
44
4.1.
SYNTHESE
DER
BIOTINYLIERTEN
PEPTIDE
.
44
4.1.1.
AUSWAHL
DER
PEPTIDSEQUENZEN
.
44
4.1.2.
SYNTHESE,
REINIGUNG
UND
ANALYSE
DER
PEPTIDE
.
46
4.2.
ENTWICKLUNG
EINES
RADIOAKTIVEN
TRACERSYSTEMS
AUF
DER
BASIS
EINES
125
IOD-MARKIERTEN
BIOTINDERIVATS
.
51
4.2.1.
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
BIOTINYLMONOIODOHISTAMIN
(BMIH)
UND
BIOTINYLHISTAMIN
(BH)
.
51
X
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.2.
DARSTELLUNG
UND
HOCHREINIGUNG
VON
BIOTINYLMONO
125
IODOHISTAMIN
.
57
4.3.
IMMOBILISIERUNG
VON
AVIDIN
UND
STREPTAVIDIN
AN
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
UND
BINDUNG
DER
BIOTINY
LIERTEN
PEPTIDE
.
64
4.3.1.
EINSATZ
DES
TRACERSYSTEMS
ZUR
BESTIMMUNG
VON
(STREPT-)AVIDINBINDUNGSSTELLEN
.
65
4.3.2.
OPTIMIERUNG
DER
BESCHICHTUNGSBEDINGUNGEN
FUER
AVIDIN
UND
STREPTAVIDIN
.
67
4.3.3.
STABILITAET
DES
AVIDINS
UND
DES
AVIDIN/BIOTINKOMPLEXES
AUF
DER
OBERFLAECHE
.
71
4.3.4.
BINDUNG
DER
BIOTINYLIERTEN
PEPTIDE
.
74
4.4.
IMMUNOASSAY
.
76
4.4.1.
ELISA
MIT
KANINCHENHYPERIMMUNSEREN
.
77
4.4.2.
ELISA
MIT
HUMANSEREN
.
87
5.
DISKUSSION
.
92
5.1.
SYNTHESE
DER
BIOTINYLIERTEN
PEPTIDE
.
92
5.2.
ENTWICKLUNG
EINES
RADIOAKTIVEN
TRACERSYSTEMS
AUF
DER
BASIS
EINES
125
IOD-MARKIERTEN
BIOTINDERIVATS
.
93
5.3.
IMMOBILISIERUNG
VON
AVIDIN
AN
POLYSTYROLOBERFLAECHEN
.
95
5.4.
IMMUNOASSAY
.
97
6.
LITERATUR
.
101
DANKSAGUNG
.
XI
LEBENSLAUF
.
XIII |
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| title_short | Synthese, Immobilisierung und Einsatz biotinylierter Peptidantigene zur Bestimmung von Antikörpern gegen das M-Protein von Streptococcus pyogenes |
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