Isolierung und Expression von Cellulase-Genen des rapspathogenen Pilzes Leptosphaeria maculans:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGEN
.
VI
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
DER
RAPSPATHOGENE
PILZ
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
1
1.1.1.
ENTWICKLUNGSZYKLUS
DES
PILZES
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
2
1.1.2.
DIE
INFEKTION
VON
WINTERRAPS
MIT
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
4
1.1.3.
UNTERSCHIEDE
IN
DER
PATHOGENITAET
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
5
1.1.4.
PATHOGENITAETSFAKTOREN
.
6
1.2.
DIE
WIRTSPFLANZE
RAPS
.
8
1.2.1.
DIE
WIRTSCHAFTLICHE
BEDEUTUNG
VON
RAPS.
.
8
1.2.2.
ANFAELLIGKEIT
VON
RAPS
GEGENUEBER
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
INFEKTIONEN
.
9
1.2.3.
ABWEHRREAKTIONEN
BEI
DER
INFEKTION
MIT
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
10
1.3.
PHYTOPATHOGENE
ORGANISMEN
DURCHDRINGEN
DIE
STRUKTURELLEN
BARRIEREN
VON
PFLANZEN
.
12
1.3.1.
DIE
PFLANZLICHE
ZELLWAND
.
12
1.3.2.
ZELLWANDABBAUENDE
ENZYME
ALS
POTENTIELLE
PATHOGENITAETS
FAKTOREN
.
.15
1.3.2.1.
CUTINASEN
.
16
1.3.2.2.
PEKTINDEGRADIERENDE
ENZYME
.
17
1.3.2.3.
XYLANASEN
.
19
1.3.2.4.
CELLULASEN
.
19
1.3.3.
DIE
REGULATION
ZELLWANDABBAUENDER
ENZYME
.
20
1.4.
DIE
CELLULASEN
FILAMENTOESER
PILZE
.
21
1.4.1.
DIE
STRUKTUR
DES
POLYSACCHARIDS
CELLULOSE
.
21
1.4.2.
DER
CELLULOSEABBAU
.
22
1.4.3.
FUNKTIONALE
DOMAENEN
.
24
1.4.4.
ORGANISATION
DER
CELLULASE-GENE
IM
GENOM
.
26
1.4.5.
REGULATIONSMECHANISMEN
BEI
DER
SYNTHESE
VON
CELLULASEN
.
27
1.5.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
EINLEITUNG
.
28
1.6.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
29
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
30
2.1.
ORGANISMEN
.
30
2.2.
PLASMIDE
UND
PHAGEN
.
30
2.3.
CHEMIKALIEN
.
31
2.4.
HILFSMITTEL
.
33
2.5.
GERAETE
.
33
2.6.
MEDIEN
.
34
2.7.
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
.
35
2.8.
KULTIVIERUNGSMETHODEN
.
36
2.8.1.
GEWINNUNG
VON
SPORENSUSPENSIONEN
ZUR
INOKULATION
VON
MEDIEN
UND
RAPSPFLANZEN
.
36
2.8.2.
KULTIVIERUNG
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
ISOLATEN
.
36
2.8.3.
KULTIVIERUNG
UND
INOKULATION
VON
RAPSPFLANZEN
.
36
2.8.4.
KULTIVIERUNG
VON
ESCHERICHIA
CDL.
----------------------------------------------------------
37
2.8.5.
INFEKTION
VON
ESCHERICHIA
COLI
MIT
PHAGEN
.
37
2.9.
AMPLIFIZIERUNG
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
PHAGEN
.
38
2.10.
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
38
2.10.1.
VORBEHANDLUNG
VON
KULTUROBERSTAENDEN
UND
-FILTRATEN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
EXTRAZELLULAERER
PROTEINE
.
38
2.10.2.
BESTIMMUNG
VON
GESAMTPROTEIN
IN
KULTUROBERSTAENDEN
.
39
2.10.3.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
IN
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
.
39
2.10.4.
NACHWEIS
VON
8-1,4-ENDOGLUCANASEN
NACH
ELEKTROPHORETISCHER
AUFTRENNUNG
IN
NATIVEN
GELEN
.
39
2.10.5.
BESTIMMUNG
DER
CELLULASE-AKTIVITAET
IN
KULTURUEBERSTAENDEN
.
40
2.11.
METHODEN
ZUR
ISOLATION
VON
DNA
UND
RNA
.
41
2.11.1.
PLASMID-SCHNELLAUFARBEITUNG
AUS
ESCHERICHIA
CDL.
.
41
2.11.2.
PLASMID-ISOLATION
AUS
ESCHERICHIA
CDL
.
41
2.11.3.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
DURCH
ULTRAZENTRIFUGATION
IN
CSCI-HALTLGER
LOESUNG
.
42
2.11.4.
ISOLATION
VON
GENOMISCHER
LEPTOSPHAERIA
MACULANS-DNA.
.
42
2.11.5.
ISOLATION
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
AUS
GELSTUECKCHEN
.
42
2.11.6.
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
.
43
2.11.7.
ANREICHERUNG
VON
POLY(A)*-RNA
AUS
DER
GESAMT-RNA
MITTELS
OLLGO(DT)-CHROMATOGRAPHLE
.
4
3
2.12.
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
DNA
UND
RNA
.
44
2.12.1.
RESTRIKTION
VON
DNA
.
44
2.12.2.
GELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
44
2.12.2.1.
TAE-UND
TBE-GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
.
44
2.12.2.2.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
PRODUKTEN
AUS
SEQUENZIERUNGSREAKTIONEN
.
44
2.12.2.3.
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
RNA
.
45
2.12.3.
TRANSFER
VON
DNA
UND
RNA
AUF
NYLON-MEMBRANEN
.
45
2.12.3.1.
HERSTELLUNG
VON
"SOUTHERN"
UND
"NORTHEM"-BLOTS
.
45
2.12.3.2.
HERSTELLUNG
VON
PLAQUEFIITEM
.
46
2.12.3.3.
HERSTELLUNG
VON
KOJONIEFILTEM
.
46
2.12.4.
HYBRDISIERUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
46
2.12.4.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
47
2.12.4.2.
DIOXYGENIN-MARKIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
47
2.12.4.3.
FILTER-HYBRIDISIERUNG
.
4
7
2.12.4.4.
CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS
.
4
8
2.12.5.
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
49
2.12.6.
NACHWEIS
VON
CELLULASE-TRANSKRIPTEN
DURCH
REVERSTRANSKRIPTION
UND
ANSCHLIESSENDER
PCR
(RT-PCR)
.
49
2.13.
METHODEN
DER
IN
V/TRO-REKOMBINATION
.
51
2.13.1.
BEHANDLUNG
VON
VERDAUTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOPHATASE
(CIP)
.
51
2.13.2.
LIGATION
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
.
51
2.13.3.
CDNA-SYNTHESE
UND
KLONIERUNG
IN
LAMBDA
UNI-ZAPYYXR
.
YY.51
2.14.
IN
V/VO-EXCISION
DES
PLASMIDES
PBLUESCRIPT
AUS
UNI-ZAPYYXR
.
52
2.15.
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
UND
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
52
2.15.1.
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
MIT
HILFE
VON
ELEKTRO
PORATION
.
52
2.15.2.
TRANSFORMATION
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
53
2.16.
SEQUENZANALYSE
.
54
2.17.
BERECHNUNG
VON
PUTATIVEN
SIGNALSEQUENZ-SCHNITTSTELLEN
.
54
3.
ERGEBNISSE
.
55
3.1.
NACHWEIS
VON
ENDOGLUCANASEN
IN
FLUESSIGKULTUREN
VERSCHIEDENER
LEPTOSPHAERIA
MACU/ANS-LSOLATE
.
55
3.2.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
CDNA
EINES
PUTATIVEN
CELLULASE-GENS
.
57
3.2.1.
ISOLATION
VON
POLY(A)+-RNA
UND
HERSTELLUNG
VON
CDNA-BANKEN
.
57
3.2.2.
ISOLATION
EINES
PUTATIVEN
CELLULASE-CDNA-KLONS
.
59
3.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
CDNA
.
60
3.2.4.
INDUKTION
DES
ZUM
CDNA-LNSERT
VON
PLM3-1
KORRESPONDIE
RENDEN
TRANSKRIPTES
.
62
3.2.5.
SEQUENZIERUNG
DES
INSERTS
VON
PLM3-1
.
64
3.3
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
STRUKTURGENE
VON
CELL
UND
CE/2
.
65
3.3.1.
ISOLATION
DER
GENOMISCHEN
CE/F-REGION
UND
EINES
WEITEREN
PUTATIVEN
CELLULASE-GENS
.
65
3.3.2.
"SOUTHERN'-ANALYSE
DER
ISOLIERTEN
GENOMISCHEN
KLONE
.
67
3.3.3.
SEQUENZANALYSE
DER
INSERTS
DER
PLASMIDE
PLM3-1G
UND
PLM2-2EB
.
70
3.3.3.1.
DIE
SEQUENZIERUNG
DES
CE/MNSERTS
IM
PLASMID
PLM3-1G
.
70
3.3.3.2.
SEQUENZANALYSE
DES
CE/2-LNSERTS
AUF
DEM
PLASMID
PLM2-2EB
.
73
3.3.3.3.
PUTATIVE
INTRONS
IN
CELL
UND
CE/2
.
77
3.3.3.4.
CODON-GEBRAUCH
IN
CE/F
UND
CE/2
.
78
3.3.3.5.
DIE
PRAESEQUENZEN
DER
VON
CE/F
UND
CE!2
ABGELEITETEN
AMINO
SAEURESEQUENZEN
.
7
9
3.3.3.6.
PUTATIVE
GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN
IN
DEN
VON
CE/F
UND
CE/2
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
.
79
3.3.3.7.
SEQUENZVERGLEICHE
MIT
CELLULASE-GENEN
ANDERER
PILZE
.
80
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
VON
CELL
UND
CE/2
.
84
3.4.1.
TRANSFORMATION
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
ZUR
INAKTIVIERUNG
DES
CE/1-GENS
.
84
3.4.2.
INDUKTION
VON
CEL2
IN
FLUESSIGKULTUREN
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
85
3.4.3.
INOKULATION
VON
RAPSPFLANZEN
MIT
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
ZUR
ISOLATION
VON
RNA
AUS
INFIZIERTEN
PFLANZENGEWEBEN
.
87
3.4.4.
TRANSKRIPTION
VON
CELL
UND
CE/2
IN
GEWEBEN
INFIZIERTER
RAPSPFLANZEN
.
89
3.4.5.
"NORTHEM
'
-ANALYSE
VON
RNA
AUS
INFIZIERTEN
PFLANZENGEWEBEN
.
93
4.
DISKUSSION
.
95
4.1.
ISOLATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZWEI
PUTATIVEN
CELLULASE
GENEN
AUS
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
95
4.1.1.
ISOLATION
VON
ZWEI
PUTATIVEN
CELLULASE-GENEN
UND
IHRE
ORGANISATION
IM
GENOM
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
95
4.1.2.
INTRONS
IN
CELL
UND
CE/2
.
95
4.1.3.
TYPISCHE
SEQUENZELEMENTE
ZUR
REGULATION
DER
TRANSKRIPTION
VON
CELL
UND
CE/2
.
96
4.1.4
HINWEISE
AUF
EINEN
ZWEITEN
TRANSKRIBIERTEN
LESERAHMEN
AUF
PLM2-2EB
.
97
4.1.5.
CELL
UND
CE/2
KODIEREN
EXTRAZELLULARE
PROTEINE
.
98
4.2.
SIND
CE/1
UND
CE/2
CELLULASE-GENE?
.
9
9
4.2.1.
AEHNLICHKEITEN
VON
CE/1
UND
CE/2
MIT
ANDEREN
PILZLICHEN
CELLULASE
GENEN
.
99
4.2.2.
DIE
EIGNUNG
DES
ALS
HYBRIDISIERUNGSPROBE
VERWENDETEN
EG/1
FRAGMENTS
ZUR
ISOLATION
VON
ENDOGLUCANASE-GENEN
.
100
4.3.
TRANSFORMATION
VON
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
ZUR
ERZEUGUNG
VON
CE/7-DEFLZIENTEN
MUTANTEN
.
101
4.4.
DIE
INDUKTION
DER
CELLULASE-BILDUNG
IN
LEPTOSPHAERIA
MACULANS
.
102
4.4.1.
DIE
BILDUNG
VON
CELLULASEN
IN
FLUESSIGKULTUREN
.
102
4.4.2.
DIE
TRANSKRIPTION
VON
CE/1
UNDCEL2
IN
INFIZIERTEN
RAPSPFLANZEN
.
103
4.4.3.
DIE
GEWEBESPEZIFISCHE
INDUKTION
VON
CE/1
UND
CE/2
.
105
4.5.
AUSBLICK.
.
106
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
107
6.
LITERATUR.
.
108
DANKSAGUNG
.
122
LEBENSLAUF
.
123 |
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