Expression von rekombinanten Anti-TMV-Antikörpern in E.coli und Nicotiana tabacum und Analyse ihrer Interaktion mit TMV:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
EIGENSCHAFTEN
UND
ANWENDUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
1
1.2.
DER
THEMATISCHE
RAHMEN
DIESER
ARBEIT
.
3
1.3.
AUFBAU
UND
EINSATZ
REKOMBINANTER
ANTIKOERPER
UND
ANTIKOERPER-FRAGMENTE
.
3
1.3.1.
REKOMBINANTE
ANTIKOERPER-FRAGMENTE
.
4
1.3.2.
ALLGEMEINE
BEDEUTUNG
REKOMBINANTER
ANTIKOERPER-FRAGMENTE
.
5
1.3.3.
EINSATZ
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPER-FRAGMENTEN
IN
PFLANZEN
ZUR
BEKAEMPFUNG
VON
TMV
.
6
1.3.4.
PARALLELE
EXPRESSION
VON
SINGLE-CHAIN-FRAGMENTEN
IN
E.COLI
.
6
1.4.
GRUNDLAGEN
ZUR
BIOSYNTHESE
NATUERLICHER
UND
REKOMBINANTER
ANTIKOERPER
.
6
1.4.1.
DIE
ZELLULAEREN
VORAUSSETZUNGEN
DER
ANTIKOERPER-SYNTHESE
.
7
1.4.2.
BEKANNTE
DATEN
ZUR
EXPRESSION
REKOMBINANTER
ANTIKOERPER
IN
PFLANZEN
.
7
1.4.3.
PROBLEMATIK
DER
CYTOPLASMATISCHEN
EXPRESSION
VON
IMMUNGLOBULINEN
IN
PFLANZEN
.
8
1.5.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
IN
BAKTERIEN
.
9
1.5.1.
SIMULATION
DER
EUKARYONTISCHEN
ANTIKOERPER-SYNTHESE
DURCH
DIE
PROTEIN-SEKRETION
IN
E.COLI
.
10
1.5.1.1.
MECHANISMUS
DER
PROTEIN-SEKRETION
BEI
E.COLI
.
11
1.5.2.
VERGLEICH
DER
ANTIKOERPER-SYNTHESE
IN
MAUS-,
TABAK
UND
ECO/AZELLEN
.
12
1.6.
VERFAHREN
ZUR
HERSTELLUNG
UND
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
.
12
1.6.1.
METHODEN
ZUR
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
.
12
1.6.2.
AUFREINIGUNG
VON
ANTIKOERPER-FRAGMENTEN
MIT
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
.
13
1.6.3.
METHODIK
DER
PFLANZEN-TRANSFORMATION
ZUR
EXPRESSION
VON
ANTIKOERPERN
.
14
1.7.
GRUNDLAGEN
ZUR
BEKAEMPFUNG
VON
TMV
DURCH
ANTI-TMV-ANTIKOERPER
.
15
1.7.1.
ALLGEMEINES
UEBER
TMV
UND
PFLANZEN-VIREN
.
15
1.7.2.
DETAILS
ZUR
SYSTEMISCHEN
VERMEHRUNG
UND
AUSBREITUNG
VON
TMV
.
17
1.7.3.
SYMPTOME,
PFLANZEN-SCHAEDEN
UND
NATUERLICHE
RESISTENZ
BEI
TMV
.
18
1.8.
ANSAETZE
ZUR
BEKAEMPFUNG
VON
TMV
MIT
REKOMBINANTEN
ANTI-TMV-ANTIKOERPEM
.
19
1.8.1.
UEBERSICHT
DER
ALLGEMEINEN
MOEGLICHKEITEN
.
19
1.8.2.
EIGENSCHAFTEN
DER
VERWENDETEN
TMV-HUELLPROTEIN-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER
.
20
1.8.3.
UEBERSICHT
DER
GEPLANTEN
ARBEITEN,
BASIEREND
AUF
DEN
EIGENSCHAFTEN
DER
ANTI-TMV-ANTIKOERPER
.
21
1.8.3.1.
PROJEKT-TEIL
1:
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
UND
IHREN
FRAGMENTEN
.
22
1.8.3.2.
PROJEKT-TEIL
2:
AUSARBEITUNG
VON
SYSTEMISCHEN
RESISTENZTESTEN
ZUR
BONITUR
DER
WECHSELWIRKUNG
VON
TMV
INFEKTIONEN
MIT
DEN
IN-VIVO
EXPRIMIERTEN
ANTIKOERPERN
.
22
1.8.3.3.
PROJEKT-TEIL
3:
KONZEPT
ZUR
KLONIERUNG
DES
BIP-PROTEINS
UND
SEINER
EXPRESSION
IN
TABAK
.
23
1.9.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
BISHER
DISKUTIERTEN
PUNKTE
.
23
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
24
2.1.
MATERIAL
.
24
2.1.1.
ENZYME,
CHEMIKALIEN,
MATERIALIEN
UND
GERAETE
.
24
2.1.2.
ANTIKOERPER,
OLIGONUKLEOTIDE,
CDNAS,
VEKTOREN,
PFLANZEN
UND
BAKTERIEN
.
24
2.1.3.
ABBILDUNGEN
UND
GRAPHISCHE
DOKUMENTATION
.
25
2.2.
METHODEN
.
25
2.2.1.
STANDARD-LABORARBEITEN,
ANZUCHT
UND
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
UND
PFLANZEN
.
25
2.2.2.
DNA
UND
RNA-ISOLATION
AUS
ZELLEN
UND
AGAROSE-GELEN
.
27
2.2.3.
RNA-ISOLATION
AUS
PFLANZEN
.
28
2.2.4.
PROTEIN-ISOLATION
AUS
PFLANZEN
.
28
2.2.5.
EXPRESSION
UND
PROTEIN-ISOLATION
VON
SINGLE-CHAINS
AUS
E.COLI
.
29
2.2.6.
ELISA-TECHNIKEN
ZUM
NACHWEIS
VON
ANTIKOERPERN
UND
VIREN
.
30
2.2.7.
COMPUTER-AUSWERTUNGEN
VON
ELISA-DATEN
ZUR
KONZENTRATIONS-BESTIMMUNG
.
31
2.2.8.
RESISTENZ-TESTE:
INFEKTION
UND
BONITURVON
PFLANZEN
MITTMV
.
31
3.
ERGEBNISSE
.
32
3.1.
HERSTELLUNG
DER
CONA
UND
VEKTOR-KONSTRUKTIONEN
ZUR
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
ANTI-TMV
ANTIKOERPER
IN
TABAK
UND
ECOLI
(PROJEKT-TEIL
1)
.
32
3.1.1.
TERMINOLOGIE
DER
EXPRESSIONS-KONSTRUKTIONEN,
PFLANZEN
UND
ANTIKOERPER
.
32
3.1.2.
HERSTELLUNG
DER
CDNA
UND
VEKTOR-KONSTRUKTIONEN
FUER
DIE
EXPRESSION
DES
MAK29
UND
MAK-META1
IN
TABAK
33
3.1.3.
HERSTELLUNG
DER
CDNA
UND
VEKTOR-KONSTRUKTIONEN
FUER
DIE
EXPRESSION
DER
FAB
UND
F(AB
'
)2-FRAGMENTE
DES
MAK24
IN
TABAK
.
34
3.1.4.
HERSTELLUNG
DER
CDNA
UND
VEKTOR-KONSTRUKTIONEN
ZUR
EXPRESSION
DER
SINGLE-CHAIN-FRAGMENTE
SCA24
UND
SCA29
IN
E.COLI.
.
36
3.1.4.1.
AUSWAHL
UND
MODIFIKATION
DES
SYNTHETISCHEN
LINKERS
ZUR
VERKNUEPFUNG
DER
V-REGIONEN
.
38
3.1.4.2.
KONSTRUKTION
EINES
HIS6-AFFINITAETS-BEREICHES
UND
SEINE
INTEGRATION
IN
DIE
SCA-SEQUENZEN
.
39
3.1.4.3.
DETAILS
ZUR
AUSWAHL
UND
INTEGRATION
DES
ECO/F-SIGNAL-PEPTIDES
IN
DIE
SCA-SEQUENZEN
.
40
3.1.4.4.
DETAILS
ZUR
ABLEITUNG
DER
PCR-PRIMER
UND
MODIFIKATION
DER
V-REGION-SEQUENZEN
.
41
3.1.4.5.
AUSWAHL
DES
ECO/I-EXPRESSIONS-SYSTEMS
UND
INTEGRATION
DER
SCAS
IN
DEN
VEKTOR
PET22B
.
43
3.1.4.6.
KONZEPT
ZUR
UMKLONIERUNG
DER
SINGLE-CHAINS
IN
DEN
PFLANZEN-VEKTOR
PSS-HI
.
44
3.2.
ERGEBNISSE
ZUR
EXPRESSION
DER
SINGLE-CHAINS
SCA24
UND
SCA29
IN
E.COLI
.
45
3.2.1.
ALLGEMEINES,
GLIEDERUNG
UND
UEBERSICHT
.
45
3.2.2.
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
ECO/F-EXPRESSIONSSTAEMME
.
45
3.2.3.
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
ZELLAUFSCHLUSS-VERFAHREN
.
46
3.2.4.
AFFINITAETS-AUFREINIGUNG
DER
SINGLE-CHAINS
.
47
3.2.5.
ELISA-ANALYSE
DER
IMAC-ELUATE
.
48
3.3.
ERGEBNISSE
DER
TABAK-TRANSFORMATIONEN
UND
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
50
3.3.1.
UEBERSICHT,
GLIEDERUNG
UND
BEKANNTE
DATEN
DER
ANTIKOERPER-EXPRESSION
IN
PFLANZEN
.
50
3.3.2.
TRANSFORMATION
VON
NICOTIANA
TABACUM
UND
AUSBEUTE
AN
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
51
3.3.3.
ANALYSE
DER
ANTIKOERPER-EXPRESSION
IN
DEN
PFLANZEN
MIT
ELISA
UND
NORTHERN-BLOT-TESTEN
.
52
3.3.3.1.
UEBERSICHT
DER
DURCHGEFUEHRTEN
ELISA-ANALYSEN
.
52
3.3.3.2.
ANALYSE
DER
PFLANZEN
DURCH
VERGLEICH
VON
ELISA-DATEN
UND
NORTHERN-BLOT-UNTERSUCHUNGEN
.
55
3.3.3.3.
UNTERSCHIEDLICHE
MRNA-EXPRESSION
DER
EINZELKETTEN
UND
EINFLUSS
AUF
DIE
ANTIKOERPER-MENGE
.
58
3.3.4.
GROESSENBESTIMMUNG
VON
FAB
UND
F(AB')2-FRAGMENTEN
(WESTERN-BLOT-ANALYSE)
.
61
3.3.5.
NACHWEIS
DER
SEKRETION
VON
F(AB
'
)2-FRAGMENTEN
IN
DEN
INTERZELLULAEREN
BLATTRAUM
.
64
3.3.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
POLYADENYLIERUNG
DER
ANTIKOERPER-MRNA
IN
TABAKPFLANZEN
.
65
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SYSTEMISCHEN
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
TRANSGENEN
TABAKPFLANZEN
(AUSARBEITUNG
VON
RESISTENZ-TESTEN,
PROJEKT-TEIL
2)
.
67
3.4.1.
ALLGEMEINES,
GLIEDERUNG
UND
UEBERSICHT
.
67
3.4.2.
VORVERSUCHE
ZUR
SYSTEMISCHEN
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
TRANSGENEM
TABAK
UND
ERARBEITUNG
VON
KRITERIEN
ZUR
QUANTITATIVEN
BONITUR
DES
PHAENOTYPS
DER
INFIZIERTEN
PFLANZEN
.
70
3.4.3.
NACHWEIS
DES
TMV-RNA-GENOMS
IN
DER
GESAMT-RNA
VON
INFIZIERTEN
TABAKPFLANZEN
.
73
3.4.4.
RESISTENZ-TEST
NR.
1:
SYSTEMISCHE
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
TRANSGENEN
SR1-PFLANZEN
(P30)
.
76
3.4.5.
RESISTENZ-TEST
NR.
2:
BEGRENZTE
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
TRANSGENEN
TABAKPFLANZEN
DER
SORTE
XANTHI
(P4,
24TCM,
MAK24)
BEI
WECHSELNDEN
TEMPERATUREN
(28
4
'
C)
.
80
3.4.6.
RESISTENZ-TEST
NR.
3:
SYSTEMISCHE
VERMEHRUNG
VON
TMV
OBERHALB
VON
28'0
UND
INDUKTION
EINES
HYPERSENSITIVEN
SCHOCKS
IN
TABAKPFLANZEN
DER
SORTE
XANTHI
(P4,24TCM,
MAK24)
.
84
3.4.7.
ELISA-ANALYSE
DER
TMV-VERMEHRUNG
IN
TRANSGENEN,
TMV-INFIZIERTEN
TABAKPFLANZEN
(ZUSAMMENFASSENDE
AUSWERTUNG
DER
RESISTENZ-VORVERSUCHE
UND
TESTE
NR.
1-3)
.
88
3.5.
KONZEPTE
ZUR
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
BIP-PROTEINS
(PROJEKT-TEIL
3)
.
92
4.
DISKUSSION
.
95
4.1.
BESONDERHEITEN
BEI
DER
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPER-EXPRESSIONS-KONSTRUKTIONEN
.
95
4.1.1.
ISOLATION
VON
ANTIKOERPER-GENEN
MIT
SIGNAL-PEPTID
ALS
VORAUSSETZUNG
FUER
DIE
EXPRESSION
.
95
4.1.1.1.
DELETIONS-MUTATIONEN
DURCH
PCR-POLYMERASEN
MIT
KORREKTUR-LESE-EIGENSCHAFT
.
95
4.1.1.2.
BESONDERHEITEN
BEI
DER
KOPPLUNG
DER
ANTIKOERPER-GENE
IN
DER
PSS-TANDEM-KONSTRUKTION
.
96
4.2.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
IN
E.COFI
.
97
4.2.1.
EXPRESSION
DER
SINGLE-CHAIN-FRAGMENTE
DER
ANTI-TMV-ANTIKOERPER
MAK24
UND
MAK29
.
97
4.2.2.
EXPRESSION
VON
FAB-FRAGMENTEN
DER
ANTI-TMV-ANTIKOERPER
IN
E.COLI.
.
98
4.3.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
IN
NICOTIANA
TABACUM
_
99
4.3.1.
ALLGEMEINE
ERGEBNISSE
ZUR
EXPRESSION
DER
ANTIKOERPER-GENE
IM
PFLANZEN-GENOM
.
99
4.3.2.
VERGLEICH
VON
CYTOPLASMATISCHER
EXPRESSION
UND
SEKRETION
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
.
100
4.3.3.
ZUKUENFTIGE
ARBEITEN
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
ANTIKOERPER-EXPRESSION
IN
PFLANZEN
.
101
4.4.
RESISTENZ-VERHALTEN
DER
ANTIKOERPER-PRODUZIERENDEN
PFLANZEN
GEGEN
TMV
.
102
4.4.1.
BISHERIGE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INFEKTION
UND
SYSTEMISCHEN
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
DEN
TRANSGENEN,
ANTIKOERPER-PRODUZIERENDEN
PFLANZEN
.102
4.4.1.1.
REDUKTION
DER
VIRALEN
INFEKTION
DURCH
DEN
MAK24-P
.
102
4.4.1.2.
SYSTEMISCHE
VERMEHRUNG
VON
TMV
IN
DEN
TRANSGENEN
PFLANZEN
.
103
4.4.2.
ZUKUENFTIGE,
WEITERFUEHRENDE
ARBEITEN
ZUR
BEKAEMPFUNG
VON
TMV
IN
TABAKPFLANZEN
.
107
4.5.
PROJEKTUEBERGREIFENDE
BEDEUTUNG
VON
REKOMBINANTEN
PFLANZEN-ANTIKOERPEM
.
108
4.5.1.
ALLGEMEINE
ANWENDUNG
VON
IN
PFLANZEN
EXPRIMIERTEN,
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
.
108
4.5.2.
VERWENDUNG
VON
REKOMBINANTEN
ANTIKOERPERN
ALS
REZEPTOREN
IN
DER
MEMBRAN
VON
PFLANZEN
.109
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
111
6.
ANHANG
.
113
6.1.
ABKUERZUNGEN
.
113
6.2.
CDNA-SEQUENZ
DER
SINGLE-CHAIN-KONSTRUKTION
SCA24
.
114
6.3.
ECOFI-EXPRESSIONSVEKTOR-KONSTRUKTION
PET22B-SCA24
BZW.
PET22B-SCA29
.
115
6.4.
STRUKTUR
DER
ANTIKOERPER-PF
LANZEN-EXPRESSIONSVEKTOREN
.
116
6.5.
VERWENDETE
ANTIKOERPER,
ORGANISMEN
UND
NUKLEINSAEUREN
.
117
6.5.1.
ANTIKOERPER,
ANTISEREN
UND
REAGENTIEN
FUER
ELISA-TEST
UND
WESTERN-BLOT
.
117
6.5.2.
VERWENDETE
BAKTERIEN,
VIREN
UND
PFLANZEN
.
117
6.5.3.
NUKLEINSAEUREN,
PLASMIDE,
CDNA
UND
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
118
6.6.
AUFLISTUNG
ALLER
TRANSGENEN
PFLANZEN
UND
IHRER
EIGENSCHAFTEN
.
120
7.
LITERATUR
.
122 |
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