Bestimmung der nichttranslatierten Bereiche im Genom des Virus der infektiösen Bursitis (IBDV):
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
UND
PROBLEMSTELLUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
4
2.1
VIRUSSTAEMME
4
2.2
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
'4
2.3
PUFFER
7
2.4
ZELLKULTUREN
11
2.5
VIRUSVERMEHRUNG
IN
ZELLKULTUREN
11
2.6
TITRATION
DER
PLAQUEBILDENEN
EINHEITEN
(PLAQUETEST)
11
2.7
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
(SNT)
11
2.8
VIRUSREINIGUNG
12
2.9
EXTRAKTION
DER
VIRALEN
RNA
13
2.10
EXTRAKTION
DER
GESAMTZELLULAEREN
NUKLEINSAEUREN
13
2.11
CDNA-SYNTHESE
ZUR
KLONIERUNG
DES
STAMMES
P2
14
2.12
PRAEPARATION
VON
PLASMIDVEKTOREN
15
2.13
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
16
2.14
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
17
2.15
MINIPRAEPARATION
VON
BAKTERIENKULTUREN
17
2.16
RESTRIKTIONSSPALTUNG
18
2.17
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
18
2.18
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
19
2.19
SDS-POIYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
20
2.20
PRAEPAERATION
DER
PROTEINPROBEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
20
2.21
FAERBEN
DER
SDS-POLYACRYLAMIDGELE
21
2.22
WESTERNBLOT
21
2.23
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
21
2.24
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
22
2.25
POLY(A)-"TAILING"
UND
REVERSE
TRANSKRIPTION
DER
DSRNA
MIT
23
ANSCHLIESSENDER
PCR
2.26
5
'
-RACE
ANWENDUNG
23
2.27
ABSPALTUNG
DER
"CAP"-STRUKTUREN
VON
DER
VIRALEN
RNA
24
2.28
RNA-LIGATION
24
2.29
KLONIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
25
2.30
DNA-SEQUENZIERUNG
25
2.31
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DES
3'-ENDES
DER
DSRNA-SEGMENTE
26
UND
ANSCHLIESSENDE
HYDROLYSE
2.32
AUFTRENNUNG
DER
HYDROLYSIERTEN
RNA
27
2.33
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
KLEINEN
ORF
DES
SEGMENTES
A
27
IN
E.COLI
2.34
HERSTELLUNG
VON
ANTISEREN
28
2.35
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VIRUSSPEZIFISCHER
PROTEINE
29
2.36
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
(RIPA)
UND
FLUOROGRAPHIE
29
2.37
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
30
2.37.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
AN
ZELLKULTUREN
30
2.37.2
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
AN
BURSAGEWEBE
31
2.38
COMPUTERPROGRAMME
31
2.39
OLIGONUKLEOTIDE
32
3.
ERGEBNISSE
33
3.1
STRUKTURELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
STAMMES
P2
33
3.1.1
NEUTRALISATION
DES
STAMMES
P2
DURCH
ANTI-CU-1-UND
33
ANTI-23/82-HYPERIMMUNSERUM
VON
KANINCHEN
SEITE
3.1.2
REPLIKATIONSEIGENSCHAFTEN
IN
DER
HEZ-KULTUR
34
3.1.3
VIRALE
STRUKTURPROTEINE
35
3.2
KLONIERUNG
DES
GENOMS
DES
STAMMES
P2
36
3.2.1
CDNA-KLONIERUNG
36
3.2.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
UND
PCR
37
3.2.3.
KLONIERUNG
DER
TERMINALEN
SEQUENZEN
DES
STAMMES
P2
37
3.2.3.1
5-RACE
38
3.2.3.2
POLY(A)-"TAILING"
DER
RNA
40
3.3
ANALYSE
DER
SEQUENZEN
DES
IBDV
STAMMES
P2
41
3.3.1
NUKLEOTID
UND
AMINOSAEURESEQUENZEN
BEIDER
GENOMSEGMENTE
41
3.3.2
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
51
3.3.2.1
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
HYPERVARIABLEN
53
REGION
DES
VP2
VERSCHIEDENER
IBDV-STAEMME
3.4
VERVOLLSTAENDIGUNG
DER
SEQUENZDATEN
BEIDER
GENOMSEGMENTE
56
VERSCHIEDENER
IBDV-STAEMME
3.4.1
ERMITTLUNG
TERMINALER
SEQUENZEN
DER
STAEMME
CU-1
,
CU-1
M
56
UND
23/82
3.4.2
VERVOLLSTAENDIGUNG
DER
SEQUENZDATEN
DER
IBDV-STAEMME
CU-1,
56
CU-1M
UND
23/82
3.4.3
VERGLEICH
TERMINALER
SEQUENZEN
VERSCHIEDENER
IBDV-STAEMME
58
3.4.4
REPETETIVE
SEQUENZEN
IN
DEN
NICHTKODIERENDEN
ABSCHNITTEN
61
3.4.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KOMPLEMENTARITAET
ZU
ANDEREN
SEQUENZEN
62
3.5
GENOMSTRUKTUR
BEIDER
SEGMENTE
VERSCHIEDENER
IBDV-STAEMME
64
3.6
BESTIMMUNG
DES
LETZTEN
NUKLEOTIDS
BEIDER
GENOMSEGMENTE
66
3.7
UNTERSUCHUNG
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
TERMINALEN
NICHT
68
KODIERENDEN
BEREICHE
DER
STAEMME
P2,
CU-1,
CU-1M
UND
23/82
3.7.1
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
5'-NICHTKODIERENDEN
REGION
BIS
ZUM
69
STARTKODON
DES
GROSSEN
ORF
DES
SEGMENTES
A
3.7.1.1
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DES
SEROTYP
1-STAMMES
P2
69
MIT
DEM
SEROTYP
2-STAMM 23/82
3.7.1.2
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
ZWISCHEN
DEN
BEIDEN
70
SEROTYP
1
-STAEMMEN
P2
UND
CU-1
3.7.1.3
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
ZWISCHEN
DEN
BEIDEN
71
SEROTYP
1
-STAEMMEN
P2
UND
CU-1M
3.7.2
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
5'-NICHTKODIERENDEN
REGION
BIS
ZUM
74
STARTKODON
DES
KLEINEN
ORF
DES
SEGMENTES
A
3.7.2.1
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DES
SEROTYP
1-STAMMES
P2
74
MIT
DENEN
DES
SEROTYP
2-STAMMES
23/82
3.7.2.2
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
SEROTYP
1-STAEMME
P2
74
UND
CU-1
3.7.2.3
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
SEROTYP
1-STAEMME
P2
75
UND
CU-1M
3.7.3
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
3'-NICHTKODIERENDEN
REGION
DES
78
SEGMENTES
A
AB
DEM
STOPKODON
DES
GROSSEN
ORF
3.7.3.1
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DES
SEROTYP
1-STAMMES
P2
78
MIT
DENEN
DES
SEROTYP 2-STAMMES
23/82
3.7.3.2
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
SEROTYP
1-STAEMME
P2,
78
CU-1
UND
CU-1M
3.7.4
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
5'-NICHTKODIERENDEN
REGION
BIS
ZUM
81
STARTKODON
DES
VP-1
DES
SEGMENTES
B
3.7.4.1
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
SEROTYP
1-STAEMME
P2,
81
CU-1,
CU-1M
UND
DES
SEROTYP
2-STAMMES
23/82
SEITE
3.7.5
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
3'
-NICHTKODIERENDEN
REGION
DES
SEGMENTES
B
AB
DEM
STOPKODON
DES
VP
1
84
3.7.5.1
VERGLEICH
DER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
DER
SEROTYP
1
-STAEMME
P2,
CU-1,
CU-1M
UND
DES
SEROTYP
2-STAMMES
23/82
84
3.7.6
SIMULATION
VON
BASENAUSTAUSCHEN
IM
5'-NICHTKODIERENDEN
BEREICH
DES
SEGMENTES
A
87
3.8
ANALYSE
DER
OFFENEN
LESERAHMEN
IN
DEN
GENOMSEGMENTEN
A
UND
B
DER
SEROTYP
1-STAEMME
P2,
CU-1,
CU-1M
UND
DES
SEROTYP
2-STAMMES
23/82
90
3.8.1
LESERAHMEN
DER
STAEMME
P2,
CU-1
UND
CU-1M
90
3.8.2
LESERAHMEN
DES
STAMMES
23/82
94
3.8.3
VERGLEICH
DER
ORF
98
3.9
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
KLEINEN
ORF
IM
SEGMENT
A
99
3.9.1
SEQUENZANALYSE
DES
KLONIERTEN
0RF-A2
IM
EXPRESSIONSPLASMID
101
3.9.2
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
DES
SEGMENTES
A
IN
BAKTERIENZELLEN
102
3.9.2.1
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
E.COLI
102
3.9.2.2
SPEZIFITAET
DES
ANTI-ORF-A2-SERUMS
GEGEN
DEN
EXPREMIERTEN
ORF-A2
105
3.9.3
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
INFIZIERTEN
ZELLKULTUREN
107
3.9.3.1
ANALYSE
IM
WESTEMBLOT
107
3.9.3.1.1
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
107
3.9.3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KINETIK
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
109
3.9.3.2
ANALYSE
IN
DER
IMMUNFIUORESZENZ
111
3.9.3.2.1
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
111
3.9.3.2.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KINETIK
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
113
3.9.3.3
ANALYSE
IM
RADIOIMMUNPRAEZIPITATIONS-TEST
(RIPA)
115
3.9.3.3.1
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
115
3.9.3.3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KINETIK
DER
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
DER
HEZ-KULTUR
118
3.9.4
EXPRESSION
DES
ORF-A2-PROTEINS
IN
BURSAGEWEBE
121
4
DISKUSSION
123
5
ZUSAMMENFASSUNG
-
SUMMARY
142
6
LITERATURVERZEICHNIS
146 |
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