Klonierung und Expression relevanter Gene des Humanen Cytomegalie-Virus in Saccharomyces cerevisiae:
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INHALTSVERZEICHNIS
L
EINLEITUNG
SEITE
1.
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
ALS
EXPRESSIONSSYSTEM
1
1.1.
LEBENSZYKLUS
UND
ALLGEMEINE
EIGENSCHAFTEN
2
1.2.
KLONIERUNG
UND
PROTEINEXPRESSION
IN
S.
CEREVISIAE
4
1.2.1.
REPLIKATIONSELEMENTE
VON
S.
CEREVISIAE
5
1.2.2.
SELEKTIONSMARKER
FUER
PLASMIDE
IN
HEFEN
5
1.2.3.
HEFE-PROMOTER
6
1.2.4.
DIE
PREPRO-REGION
1
2.
HERPESVIREN
9
2.1.
HUMANES
CYTOMEGALIEVIRUS
10
2.2.
HCMV-DIAGNOSTIK
11
2.3.
ANTIGENE
PROTEINE
DES
HCMV
11
II.
MATERIAL
15
1.
ABKUERZUNGEN
15
2.
REAGENZIEN
17
3.
HEFESTAEMME
UND
PLASMIDE
17
4.
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
UND
PLASMIDE
17
5.
HUMANES
CYTOMEGALIEVIRUS
18
6.
MEDIEN
UND
PLATTEN
18
7.
HEFE
18
8.
ESCHERICHIA
COLI
19
9.
SONSTIGES
19
M.
METHODEN
20
3.1.
ISOLIERUNG
VIRALER
DNA
20
3.2.
HEFE-METHODEN
21
3.2.1.
DNA-ISOLIERUNG
VON
S.
CEREVISIAE
21
3.2.2.
TRANSFORMATION
MIT
LITHIUMACETAT
22
3.2.3.
TRANSFORMATION
MIT
DER
SPAEROPLASTENMETHODE
23
3.2.4.
EXPRESSION
ANTIGENER
DETERMINANTEN
VON
HCMV
IN
S.
CEREVISIAE
24
3.3.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
24
3.3.1.
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
25
3.3.2.
PCR
DER
HCMV-DNA-SEQUENZEN
25
3.4.
PRAEPARATION
E.COLI-DNA
26
3.4.1.
SCHNEILPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
26
3.4.2.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
26
3.5.
REINIGUNG
VON
DNA
26
3.5.1.
PHENOLEXTRAKTION
26
3.5.2.
ETHANOLFAELLUNG
26
3.5.3.
DNA-REINIGUNG
AUS
AGAROSEGELEN
26
3.6.
GELELEKTROPHORESE
27
3.6.1.
AGAROSE-GELE
27
3.6.2.
SDS-PAGE
27
3.7.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
27
3.7.1.
AUFFUELLEN
UEBERSTEHENDER
DNA-ENDEN
MIT
DER
T4-DNA-POLYMERASE
27
3.7.2.
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
VON
DNA
27
3.7.3
LIGATION
VON
DNA
27
3.7.4.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
27
3.7.5.
TRANSFORMATION
E.COLI
27
3.7.6.
DNA-SEQUENZIERUNG
28
3.7.6.I.
SEQUENZREAKTIONEN
28
3.7.6.2.
GELHERSTELLUNG
UND
GELLAUF
29
3.8.
PROTEINREINIGUNG
UND
AUFTRENNUNG
29
3.8.1. PROTEINFAELLUNG
29
3.9.
IMMUNENZYMATISCHE
METHODEN
30
3.9.1.
IMINUNFLUORESZENZ
30
3.9.2.
IMMUNENZYMATISCHER
NACHWEIS
REKOMBINANTER
PROTEINE
30
3.9.2.I.
DIREKTER
WESTERNBLOT
30
3.9.2.2.
INDIREKTER
WESTERNBLOT
31
IV.
ERGEBNISSE
33
4.1.
VEKTORKONSTRUKTION
33
4.1.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
GALIO-PROMOTERS
UND
DER
A-PREPRO-REGION.
37
4.1.2.
"LINKER"
39
4.1.3.
KLONIERUNG
VON
GALIO-PROMOTER
UND
A-PREPRO-REGION
41
4.1.4.
DER
VEKTOR
PEW
1,
2
UND
3
42
4.2.
KLONIERUNG
RELEVANTER
GENE
DES
HCMV
AD
169
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
44
4.2.1.
PRIMER-DESIGN
44
4.2.1.1.
PRIMERDESIGN
PHOSPHOPROTEINGEN
PP28
45
4.2.I.2.
PRIMER
FUER
ANTIGENES
EPITOP
VON
GP55-58
46
4.2.I.3.
PRIMERDESIGN
FUER
DAS
GENFRAGMENT
DES
PHOSPHOPROTEINS
65
47
4.2.2.
PCR
ANTIGENER
DETERMINANTEN
DER
HCMV-GENE
PP28,
GP55
UND
PP65
48
4.2.2.I.
PCR
DES
HCMV-PROTEINGENS
PP28
48
4.2.2.2.
PCR
DES
HCMV-PEPTIDGENS
GP55
50
4.2.2.3.
PCR
DES
HCMV-PEPTIDGENS
PP65
52
4.3.
KLONIERUNG
DER
EPITOPGENE
53
4.4.
HEFE-EXPRESSION
57
4.4.1.
WACHSTUMSOPTIMIERUNG
S.
CEREVISAE
57
4.4.2.
GALAKTOSEINDUKTION
58
4.5.
IMMUNOLOGISCHE
AUSTESTUNG
REKOMBINANTER
HCMV-PEPTIDE
60
4.5.1.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
HCMV-PEPTIDE
60
4.5.2.
DIREKTER
"WESTERNBLOT"
61
4.5.3.
INDIREKTER
"WESTERNBLOT"
REKOMBINANTER
HCMV-PEPTIDE
-
SCREENING
DER
REKOMBINANTEN
PEPTIDE
62
V.
DISKUSSION
67
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
72
VN.
LITERATURVERZEICHNIS
73
VM.
LEBENSLAUF
80 |
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