Untersuchungen zur Substratspezifität und Zymogenaktivierung von Human-Kathepsin H mit Hilfe von rekombinanten Kathepsin-H-Mutanten:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A. ZUSAMMENFASSUNG. 01
B. EINLEITUNG. 03
1 LYSOSOMALE CYSTEINPROTEASEN . 03
2 DIE PAPAIN-SUPERFAMILIE . 04
3 GEZIELTE MUTAGENESE VON CYSTEINPROTEASEN DER PAPAIN-SUPERFAMILIE . 06
4 KATHEPSIN H . 15
5 AUFGABENSTELLUNG. 22
C. MATERIALIEN UND METHODEN . 26
1 MATERIALIEN. 26
2 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME. 28
3 VERWENDETE PLASMIDE. 28
4 VERWENDETE SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE . 30
5. STERILISATIONSTECHNIKEN. 31
6 KULTIVIERUNG VON
E. COLI UND ANLEGEN VON DAUERKULTUREN . 31
7 TRANSFORMATION VON . CO/T-ZELLEN. 32
8 PRAEPARATION VON PLASMID-,VIREN- UND PHAGEN-D\A . 32
8 1 PRAEPARATIVE ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA. 32
8 2 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA NACH DER QUIAGEN
R-METHODE . 33
8 3 PLASMID-SCHNELLPRAEPARATION NACH BIMBOIM UND DOLY. 34
8 4 VIRUS-DNA-ISOLIERUNG AUS YYEXTRAZELLULAEREN VIRUSPARTIKELN" (ECV). 34
8 5 PRAEPARATION VON VCS ML3-HELFERPHAGEN-DNA . 35
8 6 TITERBESTIMMUNG VON VCS ML3-HELFERPHAGEN-UEBERSTAENDEN. 35
8 7 PRAEPARATION VON EINZELSTRANG-PLASMID-DNA NACH VCS
ML3-HELFERPHAGENINFEKTION 35
9 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN. 36
9 1 CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFUGATION . 36
9 2 ABTRENNUNG FREIER NUKLEOTIDE VON SYNTHETISCHEN OLIGONUKLEOTIDEN
MITTELS GEL
PERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE AN SEPHADEX G-25 . 36
9 3 ETHANOLFAELLUNG. 36
9 4 PHENOLEXTRAKTION. 36
9 5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS PAA-GELEN. 37
10 ABSORPTIONSMESSUNGEN . 37
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
11 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA. 38
111 HYDROLYSE VON DNA. 38
112 5 -DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA. 38
113 RADIOAKTIVE 5-PHOSPHORYLIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN. 38
114 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN. 39
115 ENTFERNEN VON 3 -UEBERSTEHENDEN ENDEN. 39
11.6 DNA-SEQUENZIERUNG . 39
117 DIGOXIGENIN-DUTP MARKIERUNG VON P!ASMID-DNA . 40
12 GELELEKTROPHORESE VON DNA. 40
12.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE. 40
12 2 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE. 41
12.3 SEQUENZIERGELE . 41
12.4. FAERBUNG VON NUKLEINSAEUREN IN AGAROSE- UND PAA-GELEN . 42
12.5. DNA-GROESSENSTANDARD. 42
13 IN VITRO-MUTAGENESE. 42
13 1 GEZIELTE MUTAGENESE NACH KUNKEL . 42
13.2 GEZIELTE MUTAGENESE MITTELS YYBACK TO BACK"-PCR-METHODE. 43
14. TRANSFER UND HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN. 43
14.1 DNA-HYBRIDISIERUNG VON . CO/I-KOLONIEN. 43
14.2. HYBRIDISIERUNG VON PLASMID-DNA MITTELS
32P-MARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN . 43
14.3 DOT BLOT-ANALYSE ZUR IDENTIFIZIERUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN. 44
15. KULTIVIERUNG VON
SPODOPTERAFIVGIPERDA-ZEUEEN (SF-9) . 45
15 1 VERWENDETE ZELLINIE. 45
15 2 VERWENDETE KULTURMEDIEN . 45
15.3. SUBKULTIVIERUNG VON SF-9-ZELLEN. 46
15 4 BESTIMMUNG DER ZELLDICHTE UND LEBENSFAEHIGKEIT . 47
15.5 ANLEGEN VON SF-9-DAUERKULTUREN. 47
16 INFEKTION VON SF-9-ZELLEN . 47
16 1 COTRANSFEKTION. 47
16.2 INFEKTIONSBEDINGUNGEN . 49
17 BESTIMMUNG DES BACULOVIRUS-TITERS . 49
18 NACHWEIS VON REKOMBINANTEN BACULOVIREN. 50
18 1 LIMITIERTE VERDUENNUNGEN. 50
18.2 HYBRIDISIERUNG MIT DIGOXIGENIN-MARKIERTER PLASMID-DNA . 51
19. EXPRESSION VON REKOMBINANTEN KATHEPSIN H-MUTANTEN. 52
20 REINIGUNG VON KATHEPSIN H-MUTANTEN . 52
20.1 ZELLAUFSCHLUSS . 52
20.2 KONZENTRIEREN VON PROTEINLOESUNGEN MITTELS DRUCKFILTRATIONSZELLE. 53
20.3 FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFATF&LLUNG VON PROTEINEN . 53
20.4 UMPUFFEM VON PROTEINLOESUNGEN DURCH DIALYSE. 53
INHALTSVERZEICHNIS
20 5 CONCANAV&LIN A-AGAROSE-AFUENITAETSCHROMATOGRAPHIE . 54
20 6 LENTIL-LEKTIN-SEPHAROSE-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE . 55
20 7 HYDROXYLAPATIT-SAEULENCHROMATOGRAPHIE. 55
21 NACHWEIS VON PROTEINEN UND STEROIDEN. 56
21.1. PAA-GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN. 56
212 MOLEKULARMASSENSTANDARD. 57
21.3 SILBERFAERBUNG VON PROTEINEN IN GELEN . 57
214 DARSTELLUNG VON FILTERGEBUNDENEN PROTEINEN. 57
215 WESTERN BLOT. 58
216 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS FILTERGEBUNDENER PROTEINE. 58
21.7 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS FILTERGEBUNDENEN DIGOXIGENINS . 59
22 AKTIVIERUNGSVERSUCHE ZUR PROZESSIERUNG VON ALA-20-PROKATHEPSIN H . 61
22 1 PH-ABHAENGIGKEIT DER ZYMOGENAKTIVIERUNG. 61
22 2 ZEITLICHER VERLAUF DER ZYMOGENAKTIVIERUNG . 61
22 3 INHIBITION DER ZYMOGENAKTIVIERUNG VON ALA-20-PROKATHEPSIN H. 61
23 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR SUBSTRATSPEZIFITAET DER
DES[GLU(-18)-THR(-11 -
KATHEPSIN H-MUTANTE .T. 62
23 1. AKTIVITAETSTEST. 62
23 2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON AKTIVEM DES[GLU(-18)-THR(-11
)]-KATHEPSIN H
DURCH TITRATION MIT E-64. 64
23.3 BESTIMMUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTEN *, FUER DIE REAKTION VON
E-64 MIT
DES[GLU(-18)-THR(-11 -KATHEPSIN H. 64
23.4 BESTIMMUNG DER GLEICHGEWICHTSDISSOZIATIONSKONSTAMEN K, FUER DEN
DES[GLU(-18)-
THR(-11 -KATHEPSIN H-HUEHNEREIWEISS-CYSTATIN ENZYM-INHIBITOR-KOMPLEX. 65
23.5 BESTIMMUNG DER KONSTANTEN KM UND FUER DIE UMSETZUNG DER
PEPTIDSUBSTRATE
ARG-AMC UND Z-PHE-ARG-AMC DURCH DES[GLU(-18)-THR(-11)]- KATHEPSIN H . 67
D. ERGEBNISSE. 69
1 HERSTELLUNG VON KATHEPSIN H-MUTANTEN . 69
11 KONSTRUKTION VON PUC 118/KATH H . 70
1 2 ISOLIERUNG VON PUC 118/KATH H-SSDNA. 71
13 GERICHTETE MUTAGENESE ZUR DARSTELLUNG EINER ALA-20-KATHEPSIN
H-MUTANTE . 72
14 GERICHTETE MUTAGENESE ZUR DARSTELLUNG EINER ALA-(-14)/ALA-(212)-
KATHEPSIN H-
DOPPELMUTANTE. 72
15 DARSTELLUNG EINER DES[GLU(-18)-THR(-11 -KATHEPSIN H-DOPPELMUTANTE
AUF CDNA-
EBENE IM PLASMID PCH/ALA-14/+212. 74
2 HERSTELLUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN. 76
2.1 KONSTRUKTION EINES BACULOVIRUS-TRANSFERVEKTORS ZUR TRANSFEKTION VON
SF-9-ZELLEN
MIT MUTIERTEN PRAEPROKATHEPSIN H-GENEN . 76
2 2 ISOLIERUNG UND NACHWEIS VON BACULOVIRUS-WILDTYP-DNA . 78
2 3 COTRANSFEKTION VON SF-9-ZELLEN MIT ACNPV-DNA UND TRANSFERVEKTOR-DNA
PVL-A20 BZW PVL-DC. 79
2 4 ISOLIERUNG VON REKOMBINANTEN BACULOVIREN. 80
2 5 HERSTELLUNG VON RACV-UEBERSTANDEN UND BESTIMMUNG DES VIRUS-TITERS. 83
3 EXPRESSION UND REINIGUNG VON ALA-20-UND DES[GLU(-18)-THR(-L 1
-KATHEPSIN H . 84
INHALTSVERZEICHNIS
3 1 EXPRESSION DER KATHEPSIN H-MUTANTEN .
84
3 2 NACHWEIS VON REKOMBINANTEM ALA-20-KATHEPSIN H.
84
3 3 NACHWEIS VON REKOMBINANTEM DES[GLU(-18)-THR(-11 )]-KATHEPSIN H . 86
3 4 ISOLIERUNG DER KATHEPSIN H-MUTANTEN.
87
4 UNTERSUCHUNGEN ZUR ZYMOGENAKTIVIERUNG VON ALA-20-PROKATHEPSIN H .
93
4 1 PH-WERT-ABHAENGIGE PROZESSIERUNG VON ALA-20-PROKATHEPSIN H .
94
4 2 UNTERSUCHUNGEN ZUM ZEITLICHEN ABLAUF DER PROZESSIERUNG VON
ALA-20-PROKATHEPSIN H
BEI PH 4,0 . 95
4 3 UNTERSUCHUNGEN ZUR CHARAKTERISIERUNG DER AN DER ZYMOGENAKTIVIERUNG
VON ALA-20-
PROKATHEPSIN H BETEILIGTEN PROTEASEN MIT HILFE SPEZIFISCHER
PROTEASE-INHIBITOREN. 96
5 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR SUBSTRATSPEZIFITAET UND INHIBITION DURCH
CYSTEINPROTEASE-
INHIBITOREN DER DES[GLU(-18)-THR(-11 )]-KATHEPSIN H-MUTANTE .
98
5.1 E-64-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DES[GLU(-18)-THR(-L 1 )]-KATHEPSIN
H .
98
5.2. BESTIMMUNG DER KINETISCHEN PARAMETER UND FUER DIE UMSETZUNG VON
Z-PHE-ARG-AMC UND ARG-AMC DURCH DES[GLU(-18)-THR(-11 )]-KATHEPSIN H .
100
5.3 BESTIMMUNG DER GESCHWINDIGKEITSKONSTANTE FUER DIE
DES[GLU(-18)-THR(-11 )]-
KATHEPSIN H-E-64 ENZYM-INHIBITOR-KOMPLEXBILDUNG .
103
5 4. BESTIMMUNG DER GLEICHGEWICHTSDISSOZIATIONSKONSTANTEN
KT
FVIR-DIE REAKTION
ZWISCHEN HUEHNEREIWEISS-CYSTATIN UND DES[GLU(-18)-THR(-11 )]-KATHEPSIN H .
105
E. DISKUSSION . 108
F. LITERATURVERZEICHNIS. 124 |
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