Selektionsverfahren zur Isolierung von Mutanten der Hitzeschock-Reaktion bei Arabidosis thaliana:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1.1
DIE
HITZESCHOCK-REAKTION
1
1.2
REGULATION
DER
HS-REAKTION
6
1.2.1
REGULATION
AUF
TRANSKRIPTIONSEBENE
6
1.2.2
POSTTRANSKRIPTIONELLE
REGULATION
8
1.3
METHODEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
HS-REGULATION
10
1.4
SELEKTIONSSYSTEME
ZUR
ISOLIERUNG
VON
HS-MUTANTEN
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
2.1
BAKTERIENSTAEMME
15
2.2
PLASMIDE
15
2.2.1
PLASMIDE
MIT
HITZESCHOCK-GENSEQUENZEN
15
2.2.2
PLASMIDE
MIT
DEM
HYGROMYCIN-RESISTENZGEN
16
2.2.3
PLASMIDE
MIT
RRNA-GENEN
AUS
CUCURBITA
PEPO
16
2.2.4
PFLANZENVEKTOREN
MIT
CHIMAEREN
HITZESCHOCKGENEN
16
2.3
TRANSGENE
ARABIDOPSIS
LINIEN
17
2.3.1
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
MIT
HITZEINDUZIERBARER
ALKOHOL
17
DEHYDROGENASE
2.3.2
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
MIT
HITZEINDUZIERBARER
HYGROMYDN
17
PHOSPHOTRANSFERASE
2.4
MEDIEN,
PUFFER,
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
18
2.4.1
MEDIEN
18
2.4.1.1
MEDIEN
ZUR
BAKTERIENANZUCHT
18
2.4.1.2
MEDIEN
ZUR
PFLANZENKULTUR
18
2.4.2
PUFFER
UND
ANDERE
LOESUNGEN
19
2.4.2.1
EXTRAKTIONSPUFFER
19
2.4.2.2
PUFFER
FUER
ELEKTROPHORESEN
20
2.4.2.3
BLOTTING-UND
HYBRIDISIERUNGSLOESUNGEN
21
2.4.2.4
SONSTIGE
LOESUNGEN
22
2.4.3
ENZYME
UND
ANTIKOERPER
23
2.4.4
KITS
24
2.4.5
CHEMIKALIEN
24
2.5
TRANSFORMATIONSMETHODEN
26
2.5.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
26
2.5.2
PFLANZENTRANSFORMATION
MITTELS
A.
TUMEFACIENS
26
2.5.2.1
TRIPARENTALE
BAKTERIENKREUZUNG
26
2.5.2.2
WURZELTRANSFORMATION
MIT
A.
TUMEFACIENS
T7
2.5.2.3
NACHWEIS
TRANSFORMIERTER
GENKONSTRUKTE
27
INHALTSVERZEICHNIS
2.6
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
28
2.6.1
AUFREINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
2.6.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
28
2.6.1.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PFLANZENMATERIAL
2.6.1.3
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
PFLANZENMATERIAL
2.6.1.4
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUSGEHEND
VON
GESAMT-RNA
2.6.2
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
2.6.2.1
PHENOLISIERUNG
2.6.2.2
ALKOHOLFAELLUNG
2.6.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA,
RNA
UND
NUKLEOTIDEN
2.6.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
2.6.5
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
2.6.5.1
VERDAUUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
2.6.5.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
2.6.5.3
LIGATION
VON
DNA
2.6.6
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
2.6.7
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
(PCR)
2.6.8
MARKIERUNG
VON
DNA
UND
RNA-MATERIAL
2.6.8.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
2.6.8.2
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DIGOXIGENIN
2.6.8.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA-FRAGMENTEN
2.6.9
HYBRIDISIERUNG
MIT
DNA
UND
RNA-SONDEN
2.6.9.1
SOUTHERN
BLOTTING
2.6.9.2
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
2.6.9.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
PROBEN
2.6.9.4
NORTHEM-BLOTTING
2.6.9.5
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
2.6.10
DNA-SEQUENZIERUNG
2.7
BIOCHEMISCHE
METHODEN
2.7.1
PROTEINMENGENBESTIMMUNG
2.7.2
NACHWEIS
VON
HSP17.6
MITTELS
ANTIKOERPER
(WESTERN
BLOTTING)
R
F
AE
B
W
W
W
W
Q
J
W
C
P
W
W
W
W
Q
J
UE
J
UE
J
W
U
J
W
W
W
W
W
W
W
W
UE
J
W
W
W
W
W
W
2.7.2.1
HERSTELLUNG
EINES
PROTEINROHEXTRAKTS
2.7.2.2
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
2.7.2.3
TRANSFER
IM
SEMI-DRY
VERFAHREN
2.7.2.4
DETEKTION
DER
PROTEIN-BANDEN
2.7.3
ADH-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
40
2.7.3.1
EXTRAKTION
DER
ALKOHOLDEHYDROGENASE
40
2.7.3.2
MESSUNG
DER
ADH-AKTIVITAET
41
2.7.4
GUS-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
41
2.7.4.1
EXTRAKTION
DER
SS-GLUCURONIDASE
41
2.7.4.2
MESSUNG
DER
GUS-AKTIVITAET
41
2.7.5
HPT-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
42
2.7.5.1
EXTRAKTION
DER
HYGROMYDN-PHOSPHOTRANSFERASE
42
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.5.2
NACHWEIS
UND
MESSUNG
DER
HPT-AKTIVITAET
2.8
METHODISCHER
UMGANG
MIT
PFLANZEN
UND
SAMENMATERIAL
2.8.1
OBERFLAECHENSTERILISIERUNG
VON
SAMEN
2.8.2
PFLANZENANZUCHT
2.8.3
EMS-MUTAGENESE
2.8.4
SELEKTIONSBEDINGUNGEN
FUER
TRANSGENE
PFLANZEN
2.8.4.1
SELEKTION
AUF
HYGROMYCIN-RESISTENZ
2.8.4.2
SELEKTION
AUF
ALLYLALKOHOL-RESISTENZ
2.8.5
KREUZUNG
VON
ARABIDOPSIS
PFLANZEN
2.8.6
THERMOTOLERANZ
VON
ARABIDOPSIS
KEIMLINGEN
2.8.7
HITZESCHOCK-BEHANDLUNG
VON
PFLANZENMATERIAL
2.9
CHEMISCHE
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
3.
ERGEBNISSE
3.1
SELEKTIONSSYSTEM
FUER
PFLANZEN
MIT
EINER
DEFIZIENTEN
HS-REGULATION
3.1.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
OD/I^-TRANSFORMANTEN
3.1.1.1
EXPRESSION
DES
ADH^-GENS
3.1.1.2
HEMI-/HOMOZYGOTIE
DES
D/I^-GENS
3.1.1.3
KOPIENZAHLBESTIMMUNG
DES
ADH-GENS
3.1.1.4
ENTWICKLUNGSABHAENGIGKEIT
DER
ADH^-EXPRESSION
3.1.1.5
OPTIMIERUNG
DER
HS-BEDINGUNGEN
3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ALLYLALKOHOL-EMPFINDLICHKEIT
VON
SAMEN
BZW.
KEIMLINGEN
TRANSGENER
ADH^-LINIEN
3.1.2.1
ALLYLALKOHOL-EMPFINDLICHKEIT
VON
SAMEN
3.1.2.2
ALLYLALKOHOL-EMPFINDLICHKEIT
VON
KEIMLINGEN
3.1.3
MUTAGENESE
DER
AUSGEWAEHLTEN
ADH^-LINIEN
3.1.4
SELEKTION
DER
AUSGEWAEHLTEN
D/I^-LINIEN
3.2
SELEKTIONSSYSTEM
FUER
PFLANZEN
MIT
EINER
KONSTITUTIVEN
HS-REAKTION
3.2.1
OPTIMIERUNG
DER
SELEKTIONSBEDINGUNGEN
3.2.2
MUTAGENESE
DER
AUSGEWAEHLTEN
HPF^-LINIE
3.2.3
ISOLIERUNG
HYGROMYCIN-RESISTENTER
PFLANZEN
3.2.4
KONTROLLVERSUCHE
ZUR
HYGROMYCIN-SELEKTION
3.2.5
BESTIMMUNG
DER
HYGROMYCIN-PHOSPHOTRANSFERASE
AKTIVITAET
3.2.6
TRANSAKTIVIERUNG
VON
ADH"
S
IN
HYGROMYCIN-RESISTENTEN
MUTANTEN
3.2.6.1
KREUZUNGEN
VON
HPT-MUTANTEN
MIT
ADH^-LINIEN
3.2.6.2
NACHWEIS
KONSTITUTIV
GEBILDETER
D/I^-MRNA
3.2.7
SEGREGATION
DER
MUTATIONEN
IN
DER
F2-GENERATION
3.2.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
HS-ANTWORT
DER
HPT-MUTANTEN
3.2.8.1
NORTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
MIT
SONDEN
VON
HSP70(L)
UND
HSP17.6
3.2.8.2
NACHWEIS
KLEINER
HSP
MITTELS
ANTIKOERPER
88
O
\
N
-
3
\
O
O
O
O
O
O
A
\
O
\
O
*
*
I
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.8.3
VERSUCHE
ZUR
THERMOTOLERANZ
DER
ISOLIERTEN
HPT-LINIEN
90
4.
DISKUSSION
4.1
SELEKTIONSSYSTEM
FUER
PFLANZEN
MIT
EINER
DEFIZIENTEN
HS-REGULATION
91
4.2
SELEKTIONSSYSTEM
FUER
PFLANZEN
MIT
EINER
KONSTITUTIVEN
HS-REAKTION
96
5.
ZUSAMMENFASSUNG
102
6.
LITERATUR
103
7.
ANHANG
115
7.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
7.2
SCHEMATISCHE
DARSTELLUNG
DER
ADH^
5
-
UND
FTPT^-GENKONSTRUKTE
115
118 |
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