Die Funktion konservierter Aminosäuren des Elongationsfaktors Tu bei der GTP-Hydrolyse und der Bindung an Aminoacyl-tRNA: Untersuchung von Histidin-85-, Arginin-59- und Glutamat-55-Varianten des Elongationsfaktors Tu aus Thermus thermophilus
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
INHALTSVERZEICHNIS
III
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VIII
1.
EINLEITUNG
1.1
DIE
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
1
1.1.1
DIE
HETEROTRIMEREN
G-PROTEINE
2
1.1.2
DIE
KLEINEN
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
5
1.1.3
TRANSLATIONSFAKTOREN
8
1.2
DIE
STRUKTUR
DER
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
10
1.3
DIE
WECHSELWIRKUNG
VON
EF-TU
MIT
SEINEN
LIGANDEN
14
1.3.1
GTP,
GDP,
MG
2
*
14
1.3.2
EF-TS
17
1.3.3
RIBOSOMEN
17
1.3.4
AA-TRNA
18
1.4
DIE
GTPASE-AKTIVITAET
DER
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
22
1.5
ZIELSETZUNG
24
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
2.1
MATERIALIEN
26
2.1.1
GERAETE
26
2.1.2
BAKTERIENSTAEMME
26
2.1.3
BAKTERIOPHAGEN
UND
PLASMIDE
27
2.1.4
NAEHRMEDIEN
UND
ZUSAETZE
27
2.1.5
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
28
2.1.6
LOESUNGEN
UND
PUFFER
29
2.1.7
RADIOCHEMIKALIEN
30
2.1.8
MATERIALIEN
UND
GERAETE
ZUR
DETEKTION
VON
RADIOAKTIVITAET
30
2.1.9
ENZYME
UND
PROTEINE
30
2.1.10
MATERIALIEN
FUER
DIE
CHROMATOGRAPHIE
31
2.1.11
NUKLEOTIDE
UND
NUKLEINSAEUREN
31
2.1.12
BIOCHEMIKALIEN,
CHEMIKALIEN
UND
WEITERE
MATERIALIEN
31
2.2
METHODEN
32
2.1
ABSORPTIONSMESSUNGEN,
KONZENTRATIONS-UND
AKTIVITAETSBESTIMMUNGEN
32
2.2.2
ZENTRIFUGATIONEN
32
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3
ELEKTROPHORESEN
33
2.2.3.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
33
2.2.3.2
PROTEINGEL
NACH
LAEMMLI
33
2.2.3.3
HARNSTOFF-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
34
2.2.3.4
ROCKET-IMMUNOELEKTROPHORESE
34
2.2.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
35
2.2.4.1
REINIGUNG
UND
ETHANOLPRAEZIPITATION
35
2.2.4.2
PLASMIDISOLIERUNG
35
2.2.4.3
ISOLIERUNG
VON
BAKTERIOPHAGEN
M13-DNA
37
2.2.4.4
ELEKTROELUTION
VON
DNA
37
2.2.5
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
38
2.2.5.1
RESTRIKTIONSENZYME
38
2.2.5.2
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
38
2.2.5.3
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
38
2.2.5.4
T4-DNA
LIGASE
38
2.2.6
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
38
2.2.6.1
KOMPETENTE
ZELLEN
38
2.2.6.2
TRANSFORMATION
39
2.2.6.3
TRANSFEKTION
39
2.2.6.4
INFEKTION
39
2.2.7
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
39
2.2.8
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
40
2.2.9
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
40
2.2.10
REINIGUNG
VON
M13-PLAQUES
41
2.2.11
DNA-SEQUENZIERUNG
42
2.2.12
BAKTERIENKULTUR
UND
FERMENTATION
42
2.2.13
ZELLAUFSCHLUSS
NACH
LEBERMAN
43
2.2.13.1
ANALYTISCHER
MASSSTAB
43
2.2.13.2
PRAEPARATIVER
MASSSTAB
43
2.2.14
REINIGUNG
VON
T.
THERMOPHILUS-EF-TU
UND
SEINER
VARIANTEN
43
2.2.14.1
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
43
2.2.14.2
HITZEDENATURIERUNG
UND
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
44
2.2.14.3
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
44
2.2.14.4
DIALYSE
44
2.2.15
PRAEPARATION
VON
NUKLEOTIDFREIEM
EF-TU
44
-IV
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.16
AKTIVITAETSTEST
FUER
EF-TU
45
2.2.17
WESTERN-BLOTTING
45
2.2.18
PRAEPARATIVE
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
46
2.2.19
BESTIMMUNG
DER
SAEUREPRAEZIPITIERBAREN
RADIOAKTIVITAET
47
2.2.20
ISOLIERUNG
VON
70S-RIBOSOMEN
AUS
T.
THERMOPHILUS
47
2.2.21
AKTIVIERUNG
VON
EF-TU
GDP
ZU
EF-TU
GTP
48
2.2.22
ISOLIERUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
48
2.2.23
SYNTHESE
VON
MANT-GDP
48
2.2.24
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
EF-TU-VARIANTEN
49
2.2.24.1
KINETIK
DER
POLY(U)-ABHAENGIGEN
POLY(PHE)-SYNTHESE
49
2.2.24.2
GENAUIGKEIT
DER
IN
VITRO
TRANSLATION
50
2.2.24.3
KINETIK
DER
GTPASE-AKTIVITAET
50
2.2.24.4
FLUORESZENZTITRATION
51
2.2.24.5
HYDROLYSESCHUTZEXPERIMENTE
52
2.2.24.6
EF-TU-ABHAENGIGE
BINDUNG
VON
AA-TRNA
AN
DAS
RIBOSOM
52
2.2.24.7
KINETIK
DER
NUKLEOTIDDISSOZIATION
52
2.2.24.8
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DES
GDP-AUSTAUSCHES
53
2.2.24.9
KINETIK
DES
GDP-AUSTAUSCHES
IN
GEGENWART
VON
EF-TS
53
2.2.25
PRAEPARATION
EINES
S30-EXTRAKTES
AUS
E.
COLI
53
2.2.26
IN
VITRO
TRANSLATION
MIT
S30-EXTRAKTEN
AUS
E.
COLI
53
2.2.27
13
C-NMR
MESSVERFAHREN
54
2.2.28
PROTEINSEQUENZIERUNG
54
3.
ERGEBNISSE
3.1
UEBERPRODUZIERTER
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
NIMMT
AN
DER
PROTEINBIOSYNTHESE
IN
E.COLI
TEIL
56
3.1.1
IN
VIVO
UNTERSUCHUNGEN
DER
WACHSTUMSRATEN
56
3.1.2
IN
VITRO
TRANSLATION
58
3.2
MUTAGENESE
DES
TUFA-GENS
AUS
T.
THERMOPHILUS
60
3.2.1
SEQUENZSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
60
3.2.2
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
MUTIERTEN
TI/IA-GENE
61
3.2.3
UMKLONIERUNG
DER
MUTIERTEN
TUFA-GENE
IN
EINEN
EXPRESSIONSVEKTOR
62
3.3
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
DER
VARIANTEN
VON
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
63
3.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
EF-TU-VARIANTEN
HISTIDIN
85
GLYCIN,
DER
DOMAENE
I
HISTIDIN
85
GLYCIN,
HISTIDIN
85
GLUTAMIN
UND
HISTIDIN
85
LEUCIN
70
-V
INHALTSVERZEICHNIS
3.4.1
DIE
EF-TU-VARIANTE
HISTIDIN
85
GLYCIN
71
3.4.2
DIE
EF-TU-VARIANTEN
H85Q
UND
H85L
75
3.4.2.1
AKTIVITAET
IN
DER
IN
VIVOTRANSLATION
75
3.4.2.2
AKTIVITAET
IN
DER
IN
V/TROTRANSLATION
76
3.4.2.3
GENAUIGKEIT
DER
TRANSLATION
77
3.4.2.4
KINETIK
DER
GTPASE-AKTIVITAET
78
3.4.2.5
WECHSELWIRKUNG
MIT
AA-TRNA
81
3.4.2.6
EF-TU-ABHAENGIGE
BINDUNG
VON
AA-TRNA
AN
DAS
RIBOSOM
83
3.4.2.7
WECHSELWIRKUNG
MIT
EF-TS
84
3.4.2.8
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
DER
GDP-BINDUNG
85
3.4.2.9
GESCHWINDIGKEIT
DER
NUKLEOTIDDISSOZIATION
86
3.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
EF-TU
VARIANTE
ARGININ
59
THREONIN
87
3.5.1
AKTIVITAET
IN
DER
IN
VIVOTRANSLATION
87
3.5.2
AKTIVITAET
IN
DER
IN
V/TROTRANSLATION
88
3.5.3
GENAUIGKEIT
DER
TRANSLATION
88
3.5.4
KINETIK
DER
GTPASE-AKTIVITAET
89
3.5.5
WECHSELWIRKUNG
MIT
AA-TRNA
91
3.5.5.1
HYDROLYSESCHUTZ
91
3.5.5.2
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTE
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
92
3.5.6
EF-TU-ABHAENGIGE
BINDUNG
VON
AA-TRNA
AN
DAS
RIBOSOM
93
3.5.7
WECHSELWIRKUNG
MIT
EF-TS
93
3.5.8
WECHSELWIRKUNG
MIT
DEM
NUKLEOTID
94
3.5.9
13
C-NMR-MESSUNGEN
94
3.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
EF-TU
VARIANTE
GLUTAMAT
55
LEUCIN
98
3.6.1
AKTIVITAET
IN
DER
IN
VIVOTRANSLATION
99
3.6.2
AKTIVITAET
IN
DER
IN
VITROTRANSLATION
100
3.6.3
GENAUIGKEIT
DER
TRANSLATION
100
3.6.4
KINETIK
DER
GTPASE-AKTIVITAET
101
3.6.5
WECHSELWIRKUNG
MIT
AA-TRNA
102
3.6.5.1
HYDROLYSESCHUTZ
102
3.6.5.2
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTE
DES
TEMAEREN
KOMPLEXES
103
3.6.6
EF-TU-ABHAENGIGE
BINDUNG
VON
AA-TRNA
AN
DAS
RIBOSOM
103
3.6.7
WECHSELWIRKUNG
MIT
EF-TS
104
-VI
INHALTSVERZEICHNIS
3.6.8
WECHSELWIRKUNG
MIT
DEM
NUKLEOTID
104
4.
DISKUSSION
4.1
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
NIMMT
IN
E.
COLI
AN
DER
TRANSLATION
TEIL
105
4.2
EINFLUSS
VON
HISTIDIN
85
AUF
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
EF-TU
106
4.2.1
DIE
SWITCH
IL-REGION
DES
EF-TU
107
4.2.2
AUSWIRKUNGEN
DES
AMINOSAEUREAUSTAUSCHES
HISTIDIN
85
GLYCIN
AUF
DIE
STRUKTUR
DES
EF-TU
110
4.2.3
DIE
GTPASE-AKTIVITAET
DES
EF-TU
113
4.2.4
AUSWIRKUNGEN
VON
GLUTAMIN
UND
LEUCIN
AN
POSITION
85
AUF
DIE
GTPASE-AKTIVITAET
DES
EF-TU
114
4.2.5
EINFLUSS
VON
GLUTAMIN
UND
LEUCIN
AN
POSITION
85
AUF
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
EF-TU
121
4.3
EINFLUSS
VON
ARGININ
59
AUF
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
EF-TU
123
4.3.1
DIE
SWITCH
I-REGION
DES
EF-TU
124
4.3.2
FUNKTIONELLE
AENDERUNGEN
DURCH
DEN
AUSTAUSCH
VON
ARGININ
59
GEGEN
THREONIN
126
4.3.3
FUNKTION
VON
ARGININ
59
BEI
DER
BINDUNG
VON
AMINOACYL-TRNA
128
4.4
EINFLUSS
VON
GLUTAMAT
55
AUF
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
EF-TU
131
4.4.1
FUNKTION
VON
GLUTAMAT
55
BEI
DER
BINDUNG
VON
AMINOACYL-TRNA
131
4.4.2
AUSWIRKUNGEN
VON
LEUCIN
AN
POSITION
55
AUF
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
EF-TU
133
4.5
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
133
5.
ZUSAMMENFASSUNG
136
6.
SUMMARY
138
7.
LITERATUR
140
8.
ERKLAERUNG
153
9.
DANKSAGUNG
154
-VII |
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| spelling | Zeidler, Waltraud Verfasser aut Die Funktion konservierter Aminosäuren des Elongationsfaktors Tu bei der GTP-Hydrolyse und der Bindung an Aminoacyl-tRNA Untersuchung von Histidin-85-, Arginin-59- und Glutamat-55-Varianten des Elongationsfaktors Tu aus Thermus thermophilus vorgelegt von Waltraud Zeidler 1995 IX, 153 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bayreuth, Univ., Diss., 1995 Aminoacyl-tRNS (DE-588)4290440-7 gnd rswk-swf Thermus thermophilus (DE-588)4319830-2 gnd rswk-swf Wechselwirkung (DE-588)4064937-4 gnd rswk-swf Elongationsfaktor Tu (DE-588)4319937-9 gnd rswk-swf Guanosintriphosphat (DE-588)4249533-7 gnd rswk-swf Hydrolyse (DE-588)4160918-9 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Elongationsfaktor Tu (DE-588)4319937-9 s Thermus thermophilus (DE-588)4319830-2 s DE-604 Guanosintriphosphat (DE-588)4249533-7 s Hydrolyse (DE-588)4160918-9 s Aminoacyl-tRNS (DE-588)4290440-7 s Wechselwirkung (DE-588)4064937-4 s DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006734192&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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