Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von Leukozyten-Lipocalin und TIMP-1 als Gelatinase-assoziierte Proteine:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN 1
1. ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE 4
1.1. ISOLIERUNG VON PROTEINEN AUS MENSCHLICHEN LEUKOZYTEN 4
1.1.1. ISOLIERUNG DER DREI GELATINASEFORMEN 4
1.1.2. ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DES 25 KDA PROTEINES DER 125 KDA
GELATINASEFORM 5
1.1.3. ISOLIERUNG DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS 6
1.1.4. ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG DES LEUKOZYTEN-TIMP-1 6
1.2. CHARAKTERISIERUNG DER DREI GELATINASEFORMEN 7
1.2.1. HGCL
2-INDUZIERTE AKTIVIERUNG 7
12.2. HEMMUNG DER GELATINASEFORMEN DURCH TIMP-1 8
1.2.3. EINFLUSS VON HEPARIN AUF DIE AKTIVIERUNG 9
1.3. CHARAKTERISIERUNG DES LEUKOZYTEN-TIMP-1 9
1.3.1. INHIBITORISCHE AKTIVITAET 9
1.3.2. IMMUNLOKALISIEMNG IN LEUKOZYTEN 9
1.4. CHARAKTERISIERUNG DES LEUKOZYTEN-LIPCALINS 10
1.4.1. EINFLUSS AUF DIE LEUKOZYTEN 10
1 -4.2. EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND DIE AKTIVIERUNG DER DREI
GELATINASEFORMEN 10
1.4.3. EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND DIE AKTIVIERUNG DER KOLLAGENASE 10
1.4.4. N-GLYKOSIDISCH GEBUNDENER ZUCKER 11
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
_ II
2. EINLEITUNG 12
2.1. DIE MATRIXMETALLOPROTEINASEN 12
2.1.1. DIE INHIBITOREN DER METALLOPROTEINASEAKTIVITAET 14
2.1.2. DIE DOMAENEN DER METALLOPROTEINASEN UND IHRE FUNKTION 15
2.1.3. IN VIVO-AKTIVIERUNG DER METALLOPROTEINASEN 20
2.1.4. PHYSIOLOGISCHE UND PATHOPHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DER METALLO
PROTEINASEN 21
2.2. DIE METALLOPROTEINASEN DER LEUKOZYTEN 22
2.2.1. GRANULA UND VESIKEL DER NEUTROPHILEN 23
2.2.2. ENTWICKLUNG DER GRANULA WAEHREND DER MYELOPOESE 25
3. AUSGANGSSITUATION UND ZIELSETZUNG 27
4. GERAETE UND MATERIALIEN 29
4.1. GERATE 29
4.2. MATERIALIEN 29
4.2.1. REAGENZIEN FUER DIE SAEULENCHROMATOGRAPHIE 31
4.2.2. SUBSTRATE 31
4.2.3. ENZYME, ANTIKOERPER UND ANTIKOERPERKONJUGATE 32
4.2.4. EICHLOESUNGEN 32
4.2.5. FARBSTOFFE 32
4.2.6. SONSTIGE MATERIALIEN 33
4.2.7. CHEMIKALIEN 33
INHALTSVERZEICHNIS
_ IN
5. METHODEN 35
5.1 ISOLIERUNG VON PROTEINEN AUS LEUKOZYTENGRANULA 35
5.1.1. EXTRAKTION DES GRANULAPELLETS 3 5
5.1.2. TRENNUNG VON GELATINASE UND LEUKOZYTEN-LIPOCALIN 35
5.1.3. CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG VON GELATINASE 35
5.1.31. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN GELATIN-SEPHAROSE 35
5.1.3.2. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN HEPARIN-SEPHAROSE 36
5.1.33. GELFIHRATION MITTELS FPLC 36
5.1.3 4. ISOLIERUNG DES 25 KDA PROTEINS DER 125 KDA GELATINASEFORM 37
5.1.4. IDENTIFIZIERUNG DES 25 KDA PROTEINS DAR 125 KDA GELATINASEFORM 37
5.14.1. VOLLSTAENDIGE CARBOXAMIDOMETHYLIERUNG 37
5.1.4.2. GEWINNUNG TRYPTISCHER PEPTIDE 38
5.1.5. CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS 38
5.1.5.1. AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN BLAUER SEPHAROSE 38
5.15.2. GELFILTRATION AN SEPHACRYL S1OOHR 38
5.1.5 3. REINIGUNG DES LEUKOZYTEN-LIPOCALIN-DIMERS 39
5.1.6. CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG DES GELATINASE-TIMP-1 -KOMPLEXES 39
5.1.7. CHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG VON TIMP-1 40
5.2. CHARAKTERISIERUNG DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS 40
5.2.1. EINFLUSS DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS AUF PMNL 40
5.2.1.1. ISOLIERUNG VON PMNL AUS HUMANEM VOLLBLUT 40
5.2.1.2. EINFLUSS AUF DIE DEGRANULATION DER PMNL 41
5.2.1.21. LAKTOFERRIN-ELISA 42
5.2.1.3. EINFLUSS AUF DIE CHEMOTAXIS DER PMNL 43
5.2.1.3.1. ELASTASEBE STIMMUNG 43
5.2.2. EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND DIE AKTIVIERUNG DER
GELATINASEFORMEN 44
5.2.3. EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND DIE AKTIVIERUNG DER KOLLAGENASE 44
5.2.4. DEGLYKOSILIERUNG MIT ENDOPROTEINASE F 45
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.3.
5.3.1.
5.3.2.
5.3.3.
CHARAKTERISIERUNG DER GELATINASEFORMEN
ZEITABHAENGIGE AKTIVIERUNG MIT HGCL
2
HEMMUNG DURCH TIMP
-1
AKTIVIERUNG MIT HEPARIN
45
45
45
46
5.4.
5.4.1.
5.4.2.
5.4.3.
5.4.3.1.
5.4.3.2.
CHARAKTERISIERUNG VON TIMP-1 UND GELATINASE-TIMP-L-KOMPLEI 46
HEMMUNG VON GELATINASE UND KOLLAGENASE 46
AKTIVIERUNG DES GELATINASE-TIMP
-1
-KOMPLEXES
47
IMMUNLOKALISIERUNG DES TIMP-1 IN PMNL
47
IMMUNFLUORESZENZAUFIIAHMEN
47
LASERSCAN-UNTERSUCHUNGEN -
47
5.5.
5.5.1.
5.5.2.
5.5.3.
5.5.4.
5.5.5.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
HERSTELLUNG DER GELE
PROBENVORBEREITUNG
DURCHFUEHRUNG DER ELEKTROPHORESE
SILBERFAERBUNG
MOLEKULARGEWICHTSBES
TIMMUNG
48
48
49
49
50
50
5.6.
5.6.1.
5.6.2.
5.6.3.
WESTERN BLOT
DURCHFUEHRUNG DES WESTERN BLOTS
DETEKTION DER TRANSFERIERTEN PROBEN
BLOTTEN VON PROTEINEN FUER DIE AMINOSAEURESEQUENZBESTIMMUNG
52
52
52
53
5.7.
5.8.
5.9.
AKTIVITATSTEST MIT DNP-OKTAPEPTID
BCA-TEST ZUR PROTEINBESTIMMUNG
GELATINASE-, LEUKOZYTEN-LIPOCALIN- UND TIMP-L-PROTEINBE-
STIMMUNGEN MIT ELISA
54
54
54
5.10.
REVERSED PHASE-HPLC
55
INHALTSVERZEICHNIS
V
5.11.
5.12.
5.13.
6
.
6
.
1
.
6
.
1
.
1
.
6
.
1
.
2
.
6.1.3.
6.1.4.
6
.1.4.1.
6.1.4.2.
6.1.5.
6.1.51.
6
.
1
.5.2.
6
.
1
.
5
.
3
6
.
1
.
6
.
6.1.7.
6
.
1
.
8
.
6
.
2
.
6
.
2
.
1
.
6
.
2
.
1
.
1
.
6
.
2
.
1
.
2
.
6.2.1.3.
6.2.1.4.
6
.
2
.
2
.
AUTOMATISCHE AMINOSAEURESEQUENZBESTIMMUNG
56
DARSTELLUNG VON GEUTIN-SEPHAROSE
56
DARSTELLUNG VON BLAUER SEPHAROSE
57
ERGEBNISSE
ISOLIERUNG VON GEIATINASE, LEUKOZYTEN-LIPOCALIN UND T1MP-1
AUS MENSCHLICHEN LEUKOZYTEN ~
5
G
EXTRAKTION DES LEUKOZYTENPELLETS 59
TRENNUNG VON GEIATINASE UND FREIEM LEUKOZYTEN-LIPOCALIN
59
ISOLIERUNG VON LATENT' GEIATINASE
59
TRENNUNG DER GELATINASEFORMEN 62
ISOLIERUNG DES AN GEIATINASE GEBUNDENEN 25 KDA PROTEINS 65
IDENTIFIZIERUNG DES AN GEIATINASE GEBUNDENEN 25 KDA PROTEINS
68
ISOLIERUNG DES FREIEN LEUKOZYTEN-LIPOCALIN 69
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN BLAUER SEPHAROSE 69
GELFILTRATION AN SEPHACRYL S100HR
70
UEBERPRUEFUNG DER LEUKOZYTEN-LIPOCALIN-AUFREINIGUNG 72
ISOLIERUNG DES GELATINASE-TIMP
-1
-KOMPLEXES
74
ISOLIERUNG VON TIMP
-1
75
ISOLIERUNG VON GELATINASEFRAGMENTEN
76
CHARAKTERISIERUNG DER DREI GELATINASEFORMEN
77
HGCL
RINDUZIERTE AKTIVIERUNG DER DREI GELATINASEFONNEN
77
HGCL
RINDUZIERTE AKTIVIERUNG DER 95 KDA GEIATINASE
77
HGCL
2-INDUZIERTE AKTIVIERUNG DER 125 KDA GEIATINASE 80
HGCLRINDUZIERTE AKTIVIERUNG DER 220 KDA GEIATINASE 83
VERGLEICH DER HGCL
RINDUZIERTEN AKTIVIERUNGEN 85
WECHSELWIRKUNG DER DREI GELATINASEFORMEN MIT TIMP
-1
86
INHALTSVERZEICHNIS
VI
6
.
22
.
1
.
6
.
22
.
2
.
6.2.3.
63
.
6.3.1.
6.3.1.1
6.3.1.2
6.3.2.
6.4.
6.4.1.
6.4.2.
6.4.3.
6.4.3.1.
6.4.3.2.
6.4.3.3.
6.4.4.
6.4.5.
7.
7.1.
7.2.
73
,
7.3.1
7.3.2.
HEMMUNG DER DREI GELATINASEFORMEN DURCH TIMP
-1
86
KOMPLEXBILDUNG DER DREI LATENTEN GELATINASEFORMEN MIT TIMP
-1
88
EINFLUSS VON HEPARIN AUF DIE AKTIVITAET UND DIE AKTIVIERUNG DER
GELATINASE
FORMEN OO
CHARAKTERISIERUNG DES LEUKOZYTEN-TIMP-1
IDENTITAET MIT TIMP
-1
AUS FIBROBLASTEN
PROTEINVERGLEICH
HEMMEIGENSCHAFTEN
NACHWEIS VON TEMP
-1
IN LEUKOZYTEN
88
88
88
89
89
CHARAKTERISIERUNG DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS
EINFLUSS AUF DIE DEGRANULABON DER LEUKOZYTEN
EINFLUSS AUF DIE CHEMOTAXIS DER LEUKOZYTEN
EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND AKTIVIERUNG DER LEUKOZYTAEREN METALL O-
PROTEINASEN
94
EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET DER DREI GELATINASEFORMEN
94
EINFLUSS AUF DIE AKTIVIERUNG DER GELATINASEFORMEN
99
EINFLUSS AUF DIE AKTIVITAET UND AKTIVIERUNG DER KOLLAGENASE
100
BESTIMMUNG DES ZUCKERANTEILS DES LEUKOZYTEN-LIPO
CALINS
1
Q 1
ZUSAMMENFASSUNG DER EIGENSCHAFTEN DES LEUKOZYTEN-LIPOCALINS 103
DISKUSSION
ISOLIERUNG DER DREI GELATINASEFORMEN
IDENTIFIZIERUNG DES AN GDATINASE GEBUNDENEN 25 KDA PROTEINS
CHARAKTERISIERUNG DES FREIEN LEUKOZYTEN-LIPOCALINS
HEMMUNG DER CHEMOTAXIS DER PMN LEUKOZYTEN
AKTIVIERUNG DER LEUKOZYTAEREN METALLOPROTEINASEN
104
104
105
109
109
110
INHALTSVERZEICHNIS
VN
HGCI}-INDUZIERTE AKTIVIERUNG DER DREI GDATINASEFORMEN 113
HEMMUNG DER DREI GDATINASEFORMEN DURCH TIMP-1
116
WECHSELWIRKUNG DER LATENTEN GELATINASEFORMEN MIT TIMP-1 116
NACHWEIS VON TIMP-1 IN LEUKOZYTEN
117
8
.
LITERATUR
120 |
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| spelling | Triebel, Susanne Verfasser aut Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von Leukozyten-Lipocalin und TIMP-1 als Gelatinase-assoziierte Proteine vorgelegt von Susanne Triebel 1994 VII, 129 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bielefeld, Univ., Diss. Proteine (DE-588)4076388-2 gnd rswk-swf Leukozyt (DE-588)4074195-3 gnd rswk-swf Gelatinasen (DE-588)4393001-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Leukozyt (DE-588)4074195-3 s Gelatinasen (DE-588)4393001-3 s Proteine (DE-588)4076388-2 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006705364&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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