Immunfluoreszenz-Nachweis von Virusantigen (Pseudorabiesvirus) in Organen vom Schwein mit Mikropartikeln mittels Durchflußzytometrie:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
2.
SCHRIFTTUM
2
2.1
AUJESZKYSCHE
KRANKHEIT
2
2.1.1
PERSISTIERENDE
INFEKTION
3
2.1.2.1
DAS
PSEUDORABIESVIRUS
4
2.1.2.2
VIRALE
GLYKOPROTEINE
4
2.1.2.3
BEDEUTUNG
DER
GLYKOPROTEINE
FUER
DIE
IMMUNANTWORT
7
2.1.2.4
IMPFSTOFFE
AUS
GENOM-DELETIERTEN
PRV-STAEMMEN
8
2.1.3
DIAGNOSE
DER
AUJESZKYSCHEN
KRANKHEIT
9
2.2
MIKROPARTIKEL
FUER
DEN
EINSATZ
IN
DER
DIAGNOSTIK
12
2.2.1
ANWENDUNG
VON
MIKROPARTIKELN
12
2.2.1.1
ALLGEMEINES
12
2.2.1.2
LATEX-PARTIKEL
IN
IMMUNOASSAYS
13
2.2.1.3
MESSUNG
DER
PHAGOZYTOSELEISTUNG
VON
ZELLEN
13
2.2.1.4
VERWENDUNG
VON
MIKROPARTIKELN
ALS
CARRIER
FUER
ARZNEISTOFFE
IM
ORGANISMUS
14
2.2.1.5
MARKIERUNG
VON
ZELLOBERFLACHEN
14
2.2.1.6
ZELLSEPARATION
15
2.2.1.7
MAGNETISCHE
SEPARATIONSTECHNIK
IN
DER
KLINISCHEN
DIAGNOSTIK
16
2.2.1.8
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
MIT
LATEX-PARTIKELN
19
2.2.2
AUSWERTUNGSPRINZIPIEN
VON
PARTIKEL-IMMUNOASSAYS
19
2.2.2.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
PARTIKELAGGREGATEN
19
2.2.2.2
EINZELPARTIKELMESSUNG
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
20
3.
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
23
3.1
MATERIAL
UND
METHODEN
23
3.1.1
ZELLKULTUR
UND
VIRUSMETHODIK
23
3.1.1.1
ZELLKULTUREN
23
3.1.1.2
WAHL
DES
VIRUSSTAMMES
23
3.1.1.3
VIRUSVERMEHRUNG
23
3.1.1.4
VIRUSTITRATION
24
3.1.2
INUNUNFLUORESZENZNACHWEIS
VON
VIRUSANTIGEN
IN
ZELLEN
(PK15/BEL)
24
3.1.3
DURCHFLUQZYTOMETRISCHE
MESSUNG
VON
IF-GEFAERBTEN
ZELLEN
25
3.1.3.1
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
MESSTECHNIK
25
3.1.3.2
SIGNALERFASSUNG
VON
IF-POSITIVEN
ZELLEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
28
3.1.3.3
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
IF-POSITIVER
ZELLEN
30
3.1.4
HERSTELLUNG
EINES
STANDARDS
VON
VIRUSANTIGENHALTIGEN
ZELLEN
FUER
DIE
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
32
3.1.5
UNIFORME
PARAMAGNETISCHE
MIKROPARTIKEL
32
3.1.5.1
PARAMAGNETISCHES
PRINZIP
32
3.1.5.2
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
MESSUNG
UND
AUSWERTUNG
VON
UNIFORMEN
PARAMAGNETISCHEN
MIKROPARTIKELN
35
3.1.6
IMMUNGLOBULIN-NACHWEIS
MIT
UNIFORMEN
PARAMAGNETISCHEN
MIKROPARTIKELN
38
3.1.7
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
UND
AUFBEREITUNG
ZU
IF-KONJUGATEN
41
3.1.7.1
HYBRIDOMKULTI
VIERUNG
41
3.1.7.2
REINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
MIT
HILFE
DER
PROTEIN
G-AFLINITAETSCHROMATOGRAPHIE
41
3.1.7.3
PROTEINBESTIMMUNG
42
3.1.7.4
KONJUGIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
MIT
BIOTIN
42
3.1.7.5
KONJUGIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
MIT
FITC
(FLUORESCEIN-ISOTHIOCYANAT)
43
3.1.7.6
TITRATION
DER
BIOTIN/FITC-KONJUGIERTEN
ANTIKOERPER
AN
PRV-INFIZIERTEN
UND
GLYKO
PROTEIN
GLL
EXPRIMIERENDEN
ZELLEN
(PK
15)
44
3.1.8
HERSTELLUNG
DER
FESTPHASE
IM
MIKROPARTIKELASSAY:
KOVALENTE
BINDUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
AN
PARAMAGNETISCHE
MIKROPARTIKEL
45
3.1.9
NACHWEIS
VON
GLYKOPROTEIN
GLL
VON
PRV
AUS
STANDARDISIERTEM
ANTIGENHALTIGEM
ZELLKULTURMATERIAL
MIT
DEM
MIKROPARTIKELASSAY
46
3.1.9.1
AUFBEREITUNG
DES
ANTIGENHALTIGEN
MATERIALS
46
3.1.9.2
DURCHFUEHRUNG
DES
MIKROPARTIKELASSAYS
ZUM
NACHWEIS
VON
GLYKOPROTEIN
GLL
46
3.1.9.3
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
DES
MIKROPARTIKELASSAYS
49
3.1.10
UNTERSUCHUNG
VON
ORGANMATERIAL
AUF
GLYKOPROTEIN
GLLVONPRV
50
3.1.10.1
UNTERSUCHUNG
DES
ORGANMATERIALS
IM
GLL-MIKROPARTIKELASSAY
50
3.1.10.2
UNTERSUCHUNG
DES
ORGANMATERIALS
IN
DER
ZELLKULTUR
(PK15-ZELLEN)
50
3.1.10.3
UNTERSUCHUNG
DES
ORGANMATERIALS
MIT
DER
PCR
51
3.1.10.4
IMMUNFLUORESZENZNACHWEIS
VON
GLYKOPROTEIN
GLL
IN
ZELLEN
DER
VOM
SCHWEIN
STAMMENDEN
ORGANE
51
3.2
VERSUCHE
UND
ERGEBNISSE
52
3.2.1
EXPRESSION
VON
GLYKOPROTEIN
GLL
IN
PK
15-ZELLEN
52
3.2.2
AUSWAHL
GLYKOPROTEIN
GIL-SPEZIFISCHER
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
54
3.2.3
METHODIK
DER
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
IMMUNGLOBULINEN
56
3.2.4
EFFIZIENZ
DER
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHEN
AUFREINIGUNGS
UND
KONZENTRIERUNGSTECHNIK
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
58
3.2.5
KOVALENTE
BINDUNG
VON
MAK
AN
PARAMAGNETISCHE
MIKROPARTIKEL
59
3.2.6
HERSTELLUNG
VON
IMMUNFLUORESZENZ-KONJUGATEN
AUS
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
61
3.2.6.1
BIOTINYLIERUNG
VON
MAK
61
3.2.6.2
AUSWAHL
EINES
GEEIGNETEN
KONJUGATS
FUER
BIOTIN-KONJUGIERTE
MAK
63
3.2.6.3
KONJUGIERUNG
VON
ANTIKOERPER
1/5
MIT
FITC
(FLUORESCEIN-ISOTHIOCYANAT)
65
3.2.7
VERHALTEN
DER
KONJUGIERTEN
ANTIKOERPER
AN
VIRUSANTIGENHALTIGEN
ZELLEN
(BEL/PK
15)
67
3.2.7.1
BIOTINYLIERTER
ANTIKOERPER
AN
VIRUSANTIGEN
HALTIGEN
ZELLEN;
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
KONJUGATE
67
3.2.7.2
EINFLUSS
DER
BIOTIN-KONJUGIERUNG
AUF
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
DER
ANTIKOERPER
69
3.2.7.3
FITC-KONJUGIERTER
ANTIKOERPER
1/5
AN
VIRUSANTIGENHALTIGEN
ZELLEN
71
3.2.8
AUFBEREITUNG
VIRUSANTIGENHALTIGEN
UNTERSUCHUNGSMATERIALS
73
3.2.9
NACHWEIS
VON
GLYKOPROTEIN
GLL
IN
PRV-INFIZIERTEM
ZELLKULTURMATERIAL
MIT
DEM
MIKROPARTIKELTEST
73
3.2.10
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
DES
GLL-MIKROPARTIKELTESTES
77
3.2.11
UNTERSUCHUNG
DER
ORGANE
ZWEIER
AN
AUJESZKYSCHER
KRANKHEIT
GESTORBENER
FERKEL
MIT
DEM
GLL
MIKROPARTIKELTEST
85
3.2.12
UNTERSUCHUNG
DER
VOM
SCHWEIN
STAMMENDEN
ORGANE
AUF
PRV
IN
DER
ZELLKULTUR
87
3.2.13
DIREKTE
FAERBUNG
VON
ORGANZELLEN
MIT
GIL-SPEZIFISCHEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
90
4.
BESPRECHUNG
DER
ERGEBNISSE
92
5.
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
97
6.
LITERATURVERZEICHNIS
101
7.
ANHANG
7.1
MATERIALLISTE
120
120
7.2
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
124 |
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