Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) zur Diagnostik von Chlamydien-Infektionen:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Göttingen
Cuvillier
1995
|
| Edition: | 1. Aufl. |
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | IV, 141 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3895881449 |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
.
1
1
EINLEITUNG
.
3
2
LITERATURUEBERSICHT
.
5
2.1
CHLAMYDIEN
.
5
2.1.1
ALLGEMEINES
.
5
2.1.1.1
KLASSIFIZIERUNG
.
5
2.1.1.2
CHLAMYDIEN
ALS
KRANKHEITSERREGER
.
5
2.1.1.3
ANTIGENSTRUKTUREN
.
7
2.1.1.4
"MAJOR
OUTER
MEMBRANE
PROTEIN"
(MOMP)
.
8
2.1.2
GENETIK
.
9
2.1.2.1
ALLGEMEIN
.
9
2.1.2.2
GENOMISCHE
DNA
.
9
2.1.2.2.1
MOMP-GEN
.
10
2.1.2.3
PLASMID-DNA
.
11
2.1.2.4
16S-RRNA
.
13
2.1.3
INDIREKTE
NACHWEISVERFAHREN
.
14
2.1.4
DIREKTE
NACHWEISVERFAHREN
.
15
2.1.4.1
HERKOEMMLICHE
METHODEN
.
15
2.1.4.1.1
IDEIA
R
CHLAMYDIA
TEST
.
15
2.1.4.1.2
ELISA
MIT
BLOCKING-TEST
.
15
2.1.4.1.3
CAPTURE-ELISA
.
16
2.1.4.2.
NACHWEIS
VON
NUKLEINSAEUREN
.
16
2.1.4.2.1
ANWENDUNG
VON
GENSONDEN
.
16
2.1.4.2.2
LIGASE-KETTENREAKTION
(LCR)
.
17
2.1.4.2.3
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
18
2.2
PCR
-
ALLGEMEINES
.
18
2.2.1
DEFINITION
.
18
2.2.2
GRUNDLAGEN
DER
PCR-METHODE
.
19
2.2.2.1
PRIMER
.
19
2.2.2.1.1
AUSWAHLKRITERIEN
FUER
PRIMER
.
19
2.2.2.1.2
PRIMERHERSTELLUNG
.
20
2.2.2.2
ZIEL-DNA
.
20
2.2.2.3
DNA-POLYMERASE
.
20
2.2.2.4
REAKTIONSGEMISCH
.
22
2.2.2.5
ZYKLUSBEDINGUNGEN
.
23
2.2.2.6
EFFEKTIVITAET
DER
PCR
.
23
2.2.2.7
PCR-SPEZIFITAET
.
24
2.2.3
PCR-TECHNIKEN
.
24
2.2.3.1
"NESTED"
PCR
.
24
2.2.3.2
ASYMMETRISCHE
PCR
.
25
2.2.3.3
INVERSE
PCR
.
25
2.2.3.4
MULTIPLEX-PCR
.
25
2.2.3.5
"BOOSTER"-PCR
.
26
2.2.3.6
"HOT-START"-PCR
.
26
INHALTSVERZEICHNIS
U
2.2.3.7
QUANTITATIVE
PCR
.
26
2.2.3.8
"REVERSE-TRANSKRIPTASE"-PCR
.
26
2.2.4
DARSTELLUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
27
2.2.5
KONTAMINATIONEN
.
27
2.2.5.1
VORBEUGENDE
MASSNAHMEN
.
28
2.2.6
ANWENDUNGSBEREICHE
DER
PCR
.
28
2.3
PCR
ALS
NACHWEISMETHODE
FUER
CHLAMYDIEN
.
29
2.3.1
PCR-BEDINGUNGEN
.
29
2.3.1.1
CHLAMYDIEN-PRIMER
UND
IHRE
ZIEL-DNA
.
29
2.3.1.2
AUFBEREITUNG
DES
PROBENMATERIALS
.
29
2.3.1.3
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
.
30
2.3.2.
PCR-INHIBITOREN
-
NACHWEIS
UND
GEGENMASSNAHMEN
.
31
2.3.3
"SPECIFICITY
ENHANCER
"
.
31
2.3.4
DARSTELLUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
31
2.3.5
KONTAMINATION
.
32
2.3.6
PCR-FORMEN
.
33
2.3.7
ANWENDUNGSBEREICHE
DER
CHLAMYDIEN-PCR
.
33
2.3.8
CHLAMYDIEN-PCR
IM
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
NACHWEISMETHODEN
.
33
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
34
3.1
MATERIAL
.
34
3.1.1
UNTERSUCHUNGSMATERIAL
.
34
3.1.1.1
SPERMAPROBEN
VOM
MENSCHEN
.
34
3.1.1.2
RINDER
UND
SCHAFPROBEN
.
34
3.1.1.3
DIVERSE
BAKTERIENSTAEMME
.
35
3.1.2
CHLAMYDIENISOLATE
.
36
3.1.3
CHEMIKALIEN
.
36
3.1.4
PUFFER
.
36
3.1.5
LOESUNGEN
.
38
3.1.6
ENZYME
.
39
3.1.7
AGAROSEN
.
39
3.1.8
SAEULEN
.
39
3.1.9
PCR-PRIMER
.
39
3.1.10
GENSONDEN
.
;
.
40
3.1.11
VERSCHIEDENES
.
40
3.1.12
KOMMERZIELL
ERHAELTLICHE
SYSTEME
.
40
3.1.13
GERAETE
.
40
3.1.14
COMPUTERPROGRAMME
.
40
3.2
METHODEN
.
41
3.2.1
HERSTELLUNG
STANDARDISIERTER
CHLAMYDIEN-SUSPENSIONEN
.
41
3.2.1.1
BESTIMMUNG
DER
PARTIKELZAHL
.
41
3.2.2
DNA-PRAEPARATION
.
41
3.2.2.1
PROTEINASE-K-BEHANDLUNG
.
41
3.2.2.2
REINIGUNG
DER
NUKLEINSAEUREN
.
42
INHALTSVERZEICHNIS
DI
3.2.3
AUFBEREITUNG
DES
UNTERSUCHUNGSMATERIALS
.
42
3.2.3.1
SCHAFPROBEN
.
Y
.
42
3.2.3.2
RINDERPROBEN
.
1
.
43
3.2.3.3
SPERMAPROBEN
VOM
MENSCHEN
.
43
3.2.3.4
CHLAMYDIEN-SUSPENSIONEN
UND
BAKTERIENISOLATE
.
43
3.2.4
PCR
.
43
3.2.4.1
STANDARDREAKTION
.
43
3.2.4.2
OPTIMIERUNG
DER
PCR-BEDINGUNGEN
.
44
3.2.4.2.1
PRIMERSELEKTION
.
44
3.2.4.2.2
MGCH-KONZENTRATION
.
44
3.2.4.2.3
DNA-POLYMERASE-KONZENTRATION
.
44
3.2.4.2.4
ANWENDUNG
VON
TMAC
ALS
"SPECIFICITY
ENHANCER"
.
45
3.2.4.2.5
ZYKLUSBEDINGUNGEN
("TOUCH
DOWN",
"HOT
START
"
)
.
45
3.2.4.3
PCR-KONTROLLEN
.
46
3.2.5
NACHWEIS
DER
PCR-PRODUKTE
.
46
3.2.5.1
ANALYTISCHE
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
.
46
3.2.5.2
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
47
3.2.5.3
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG
(SBH)
.
47
3.2.5.3.1
GENSONDEN
-
HERSTELLUNG
UND
MARKIERUNG
.
47
3.2.5.3.1.1
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
48
3.2.5.3.1.2
"NICK
TRANSLATION"-GENSONDEN
.
48
3.2.5.3.2
SOUTHERN-BLOT
.
49
3.2.5.3.3
HYBRIDISIERUNG
UND
NACHWEIS
.
49
3.2.5.4
SEQUENZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
50
3.2.5.4.1
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
51
3.2.5.4.2
DNA-SEQUENZIERUNGSGELE
.
52
3.2.5.4.3
SEQUENZIERUNG
.
52
3.2.5.4.4
DNA-SEQUENZANALYSE
.
53
3.2.6
STATISTISCHE
AUSWERTUNG
DER
UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
.
53
3.2.6.1
BESTIMMUNG
DER
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
.
53
4
ERGEBNISSE
.
54
4.1
PCR
.
54
4.1.1
OPTIMIERUNG
DER
PCR-VERSUCHSBEDINGUNGEN
.
54
4.1.2
BESTIMMUNG
DER
NACHWEISGRENZE
.
54
4.1.3
SPEZIFITAET
DER
PCR
.
55
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
55
4.2.1
NACHWEIS
IN
ANALYTISCHEN
AGAROSEGELEN
.
55
4.2.2
VERDAU
MIT
SPEZIFISCHEN
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
56
4.2.2.1
RESTRIKTIONSVERDAU
DES
"2A/2B"-AMPLIFIKATES
.
56
4.2.2.2
RESTRIKTIONSVERDAU
DER
"HP1/HP2
"
-
UND
"HP2/HP3"-AMPLIFIKATE
.
57
4.2.3
NACHWEIS
DURCH
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG
.
57
4.2.4
BESTAETIGUNG
DER
AMPLIFIKATSEQUENZ
DURCH
SEQUENZIERUNG
.
58
4.2.4.1
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
.
58
4.2.4.2
SEQUENZIERUNG
UND
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
.
58
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.3
PCR-ERGEBNISSE
.
58
4.3.1
SCHAF-PROBEN
.
58
4.3.2
RINDER-PROBEN
.
59
4.3.2.1
"VERSUCHSRINDER"
.
59
4.3.2.2
"BESTANDSPROBEN"
.
61
4.3.3
SPERMAPROBEN
VOM
MENSCHEN
.
62
4.3.3.1
CHLAMYDIENNACHWEIS
IM
EJAKULAT
.
62
4.3.3.2
CHLAMYDIENNACHWEIS
IM
HAMROEHRENABSTRICH
.
62
5.
DISKUSSION
.
63
5.1
PCR
-
ALLGEMEIN
.
63
5.1.1
DNA-PRAEPARATION
.
63
5.1.1.1
STANDARDISIERTE
CHLAMYDIENSUSPENSIONEN
.
63
5.1.2
PRIMERSELEKTION
.
63
5.1.3
PCR-BEDINGUNGEN
.
65
5.1.4
KONTROLLEN
.
66
5.1.5
NACHWEIS
DER
PCR-PRODUKTE
.
67
5.1.6
SEQUENZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
68
5.2
PCR-ERGEBNISSE
.
70
5.2.1
SCHAF-UND
RINDEIPROBEN
.
70
5.2.2
SPERMAPROBEN
VOM
MENSCHEN
.
72
5.2.2.1
EJAKULATBEFUND
.
72
5.2.2.2
CHLAMYDIENNACHWEIS
IM
HAMROEHRENABSTRICH
.
73
5.3
PCR
IM
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
NACHWEISMETHODEN
.
74
5.3.1
BEDEUTUNG
DER
ZELLKULTUR
ALS
GOLDENER
STANDARD
.
75
5.3.2
SENSITIVITAET
UND
SPEZIFITAET
DER
TESTSYSTEME
.
75
5.3.2.1
EIGENE
UNTERSUCHUNGEN
.
75
5.3.2.2
ZUSAMMENFASSUNG
DER
VON
ANDEREN
AUTOREN
PUBLIZIERTEN
UNTERSUCHUNGEN
.
77
5.3.3
BEDEUTUNG
DER
PCR
ALS
NACHWEISMETHODE
FUER
CHLAMYDIEN
.
80
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
82
7
SUMMARY
.
84
8
LITERATURVERZEICHNIS
.
86
9
TABELLEN
.
110
10
ABBILDUNGEN
.
133 |
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| author | Fischer, Doris |
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| discipline | Medizin |
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