Das Sexpheromonsystem von Enterococcus faecalis: Untersuchungen zu Funktion und Regulation der pAD1-kodierten Aggregationssubstanz
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1994
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INHALT
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
KONJUGATIVER
GENTRANSFER
BEI
GRAM-POSITIVEN
BAKTERIEN
.
1
1.2
DAS
SEXPHEROMONSYSTEM
VON
E
FAECALIS
.
2
1.3
DIE
DOPPELFUNKTION
DER
AGGREGATIONSSUBSTANZ
.
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
7
2.1
STAEMME
UND
PLASMIDE
.
7
2.1.1
STAEMME
(TAB.
2)
.
7
2.1.2
SEXPHEROMONPLASMIDE
(TAB.
3)
.
7
2.1.3
VEKTOREN,
HELFERPLASMIDE
UND
PHAGEN
(TAB.4)
.
8
2.1.4
REKOMBINANTE
PLASMIDE
(TAB.
5)
.
8
2.1.5
NEUKONSTRUIERTE
PLASMIDE
UND
PHAGEN
(TAB.
6)
.
9
2.2
NAEHRMEDIEN
.
12
2.3
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
13
2.3.1
ECO//.
.
13
2.3.2
PHAGEN
.
14
2.3.3
E.
FAECALIS
.
14
2.4
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
.
14
2.4.1
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
14
2.4.1.1
PLASMIDPRAEPARATIONEN
.
14
2.4.1.1.1
E
COLI
.
14
2.4.1.1.2
E.
FAECALIS
.
15
2.4.1.2
PRAEPARATION
VON
GESAMT-DNA
AUS
E
FAECALIS
.
15
2.4.1.3
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
E.
FAECALIS
.
15
2.4.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
16
2.4.3
TRANSFER
VON
PLASMID-DNA
IN
BAKTERIEN
.
16
2.4.3.1
ELEKTROTRANSFORMATION
REKOMBINANTER
PLASMIDE
.
16
2.4.3.2
UEBERPRUEFUNG
DER
INTAKTHEIT
TRANSFORMIERTER
PLASMIDE
.
16
2.4.3.3
TRANSFER
VON
SEXPHEROMONPLASMIDEN
.
17
2.4.4
IN-VITRO-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
32P.(JATP
.
17
2.4.4.1
NICKTRANSLATION
.
17
2.4.4.2
ENDMARKIERUNG
.
17
2.4.5
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
17
2.4.6
DNA-SEQUENZIERUNG
.
18
2.5
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
18
2.5.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
.
18
2.5.2
AUFTRENNUNG
VON
RNA
IN
AGAROSEGELEN
.
18
2.5.3
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
.
18
2.5.4
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
.
.
19
2.5.4.1
SDS-PAGE
.
19
2.5.4.2
AUFTRENNUNG
NATIVER
PROTEINE
.
19
2.5.5
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
PROTEIN/NUKLEINSAEURE-INTERAKTIONEN
.
20
2.6
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
.
21
2.6.1
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
.
21
2.6.1.1
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
(E.
FAECALIS)
.
21
2.6.1.2
HYBRIDISIERUNG
VON
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
.
21
2.6.2
RNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
.
21
2.7
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
22
2.7.1
GEWINNUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
22
2.7.1.1
LYSE
VON
E.
FAECALIS
.
22
2.7.1.2 LYSE
VON
E.
COLI.
.22
2.7.1.3
PRAEPARATION
VON
ZELLWANDEXTRAKTEN
AUS
E.
FAECALIS
.
23
2.7.2
UEBEREXPRESSION
DEFINIERTER
PROTEINE
MIT
DEM
T7-POLYMERASE/
PROMOTORSYSTEM
(E.
COLI)
.
23
2.7.3
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINGEMISCHEN
.
24
2.7.4
PROTEIN-NACHWEISVERFAHREN
.
24
2.7.4.1
PROTEINTRANSFER
AUF
MEMBRANEN
.
24
2.7.4.2
SEQUENZIERUNG
AMINOTERMINALER
AMINOSAEUREN
.
25
2.7.4.3
RADIOCHEMISCHER
NACHWEIS
35
S-MARKIERTER
PROTEINE
.
25
2.7.4.3.1
FLUESSIGKEITSSZINTILLATIONSZAEHLUNG
.
25
2.7.4.3.2
AUTORADIOGRAPHIE
.
25
2.7.4.4
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
.
25
2.7.4.4.1
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
.
25
2.7.4.4.2
IMMUNOBLOTTING
.
26
3
ERGEBNISSE
.
27
3.1
DIE
AGGREGATIONSSUBSTANZ
ALS
VERMITTLER
DER
VERKLUMPUNGSREAKTION:
ANALYSE
DER
BINDEDOMAENE
.
27
3.1.1
KONSTRUKTION
VON
IN-FRAME-DELETIONEN
.
28
3.1.2
VERBESSERUNG
DES
TESTSYSTEMS
.
28
3.1.2.1
ANSATZ
ZUR
DELETION
VON
ASA1
AUS
PAD1
.
28
3.1.2.2
UEBERFUEHRUNG
VON
PAM944
IN
DEN
REC
'
-STAMM
UV202
.
29
3.1.3
KOMPLEMENTATION
MIT
DEN
DELETIONSPLASMIDEN
.
30
3.1.4
AUSTAUSCH
DER
VARIABLEN
REGION
.
33
3.2
DER
POSITIVE
REGULATOR
DER
ASA
/-EXPRESSION
.
35
3.2.1
EINGRENZUNG
DES
REGULATORGENS
INNERHALB
DER
TRA-REGION
.
36
3.2.1.1
EXPRESSION
AUSGEWAEHLTER
GENE
.
37
3.2.1.2
VERGLEICHENDE
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
.
38
3.2.1.3
ANALYSE
DER
EINZELNEN
LESERAHMEN
.
42
3.2.1.3.1
ORFY
(UND
SEAT)
.
42
3.2.1.3.2
ORF3FF.
.
43
3.2.1.3.3
ORF1
.
43
3.2.1.3.4
"CW
.
44
3.2.1.3.5
DIE
INTERGENE
REGION
ZWISCHEN
ORF1
UND
ASA1
.
45
3.2.1.3.6
ANALYSE
VON
ORF1
UND
DER
INTERGENEN
REGION
MIT
HILFE
VON
LACZ
FUSIONEN
.
47
3.2.2
TRAE1:
DER
POSITIVE
REGULATOR
.
48
3.2.2.1
AUSGANGSDATEN
.
48
3.2.2.2
DER
KONSTITUTIVE
STAMM
OG1XE:PWHH6
.
49
3.2.2.3
ANSAETZE
ZUR
KONSTRUKTION
EINER
KONSTITUTIVEN
CHROMOSOMALEN
TRAE1
MUTANTE
.
51
3.2.2.3.1
ENTFERNUNG
VON
PWHH6
AUS
OG1XE:PWHH6
.
51
3.2.2.3.2
INTEGRATION
VON
TRAE1
INS
CHROMOSOM
EINES
PLASMIDFREIEN
E
FEECAFE-STAMMES
.
52
3.2.3
UEBEREXPRESSION
VON
TRAE1
IN
E.
COLI
.
53
3.2.3.1
EXPRESSION
IM
T7-SYSTEM
UND
GELSHIFT-ASSAYS
.
53
3.2.3.2
MUTAGENESE
DER
RIBOSOMENBINDESTELLE
DES
TRAE1-GENES
.
54
3.2.4
REINIGUNG
DES
TRAE1-GENPRODUKTES
.
55
3.2.4.1
ANZUCHTBEDINGUNGEN,
ZELLAUFSCHLUSS
UND
FRAKTIONIERUNG
.
56
3.2.4.2
SAEULENCHROMATISCHE
AUFTRENNUNG
VON
TRAE1
.
57
3.2.4.3
BESTIMMUNG
DES
N-TERMINUS
.
61
3.2.5
NUKLEINSAEURE-BINDEVERHALTEN
DES
GEREINIGTEN
TRAE1
.
61
3.2.6
IMMUNOLOGISCHE
ANALYSE
VON
TRAE1
.
62
3.2.6.1
GEWINNUNG
DES
ANTISERUMS
UND
TITERBESTIMMUNG
.
62
3.2.6.2
ZEITABHAENGIGE
EXPRESSION
VON
TRAE1
.
63
3.2.6.3
UNTERSUCHUNG
MOEGLICHER
PROTEIN/PROTEIN-INTERAKTIONEN
.
64
3.2.6.4
ABSCHAETZUNG
DER
TRAE1-KONZENTRATION
IN
DER
ZELLE
.
65
3.2.6.5
NACHWEIS
KREUZREAGIERENDER
PROTEINE
IN
ANDEREN
E.
FAECALIS
STAEMMEN
.
67
4
DISKUSSION
.
69
4.1
FUNKTIONELLE
DOMAENEN
DER
AGGREGATIONSSUBSTANZ
.
69
4.1.1
STRUKTURELLE
GRUNDLAGEN
DER
VERKLUMPUNGSREAKTION
.
69
4.1.2
DIE
FUNKTION
DER
VARIABLEN
REGION
.
72
4.2
DIE
POSITIVE
KONTROLLE
DER
ASA/-EXPRESSION
.
74
4.2.1
DER
POSITIVE
REGULATOR
TRAE1
.
74
4.2.2
DIE
BIOLOGISCHEN/CHEMISCHEN
EIGENSCHAFTEN
VON
TRAE1
UND
IHRE
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
FUNKTIONSANALYSE
.
76
4.2.3
MODELLE
ZUR
POSITIVEN
KONTROLLE
DER
ASA
/-EXPRESSION
.
79
4.2.3.1
TRAE1
IST
ALLEIN
ALS
POSITIVER
REGULATOR
AKTIV
.
79
4.2.3.2
TRAE1
WIRKT
GEMEINSAM
MIT
EINEM
CHROMOSOMAL
KODIERTEN
FAKTOR
.
80
4.2.3.3
TRAE1
WIRKT
GEMEINSAM
MIT
EINEM
PAD1-KODIERTEN
FAKTOR
.
80
4.3
VERWANDTSCHAFTSBEZIEHUNGEN
ZWISCHEN
DEN
SEXPHEROMONPLASMIDEN
.
84
4.3.1
VERGLEICH
DER
GENETISCHEN
ORGANISATION
POTENTIELLER
T
RANSFERGENREGIONEN
.
85
4.3.2
DIE
PHAENOTYPISCHE
VARIABILITAET
DER
SEXPHEROMONPLASMIDE
.
88
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
91
5.1
AGGREGATIONSSUBSTANZ
IST
EIN
BIFUNKTIONALES
PROTEIN
.
91
5.2
TRAE1
REGULIERT
DIE
EXPRESSION
DER
AGGREGATIONSSUBSTANZ
IN-TRANS
.
91
5.3
DIE
SEXPHEROMONPLASMIDE
STEHEN
UEBER
KOMPLEXE
VERWANDTSCHAFTSBEZIEHUNGEN
MITEINANDER
IN
VERBINDUNG
.
92
6
LITERATUR
.
93
ANHANG:
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
TRAE1
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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