Identifikation und Charakterisierung von Sexualpheromon-kontrollierten Genen und Genprodukten aus Volvox carteri f. negariensis:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
1
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
8
B.
1.
PUFFER,
MEDIEN,
BAKTERIENSTAEMME
8
B.2.
STANDARDMETHODEN
10
B.3.
KULTIVIERUNG
VON
V.
CARTERI
11
B.3.1.
STAEMME
UND
STAMMKULTURHALTUNG
11
B.3.2.
ANZUCHT
DER
ALGEN
11
B.3.3.
SEXUALINDUKTOR
11
B.4.
ISOLIERUNG
EINZELNER
ZELLTYPEN
BZW.
SPHAEROIDFRAKTIONEN
12
B.4.
1.
GEWINNUNG
VON
EMBRYONEN
12
B.4.2.
GEWINNUNG
VON
GONIDIEN
12
B.4.3.
ISOLIERUNG
SOMATISCHER
ZELLEN
12
B.4.3.
FRAKTIONIERUNG
DER
SPHAEROIDE
12
B.5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
13
B.5.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
13
B.5.1.
1.
GEWINNUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
VOLVOX
13
A.
FRAKTIONIERTE
FAELLUNGEN
13
B.
HOT-PHENOL-METHODE
14
B.5.
1.2.
PRAEPARATION
VON
POLYA
+
-MRNA
15
A.
KONVENTIONELLE
CHROMATOGRAFIE
AN
OLIGO
DT-CELLULOSE
15
B.
MRNA
PURIFICATION
KIT
15
B.5.1.3.
ANREICHERUNG
VON
VOLVOX-DNA
15
B.5.1.4.
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
16
A.
QUIAGEN-SAEULCHEN
16
B.
VERKUERZTE
METHODE
16
C.
CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
17
B.5.2.
KLONIERUNG
VON
DNA
17
B.5.2.1.
PRAEPARATION
VON
VEKTOREN
17
B.5.2.2.
AUFFULLEN
REZESSIVER
3'-TERMINI
MIT
KLENOW-POLYMERASE
17
B.5.2.3.
ABBAU
UEBERSTEHENDER
5'-ENDEN
MIT
MUNG
BEAN
NUKLEASE
18
B.5.2.4.
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
18
A.
BUENDIGE
ENDEN
18
B.
KOHAESIVE
ENDEN
18
B.5.2.5.
LIGATION
19
B.5.2.6.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
19
B.5.3.
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
20
B.5.3.
1.
POLYA
+
-MRNA
20
B.5.3.2.
DNA
20
A.
DIGOXIGENIN
20
B.
RADIOAKTIVE
DESOXYNUKLEOTIDTRIPHOSPHATE
20
B.5.3.3.
OLIGONUKLEOTIDE
21
B.5.4.
HERSTELLUNG
DER
CDNA-BANK
UND
HANDHABUNG
DER
PHAGEN
21
B.5.4.1.
SYNTHESE
DER
BANK
21
B.5.4.2.
PHAGENVERPACKUNG
21
B.5.4.3.
PLATTIEREN
DER
BANK
22
B.5.4.4.
AMPLIFIKATION
DER
PRIMAERBANK
22
B.5.4.5.
ISOLIERUNG
VON
UND
VERFAHREN
MIT
POSITIVEN
PHAGEN
22
B.5.4.6.
"/N-V/VO-EXCISION"
REKOMBINANTER
PLASMIDE
22
B.5.5.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
FILTERMEMBRANE
23
B.5.5.1.
PHAGENABKLATSCHE
23
B.5.5.2.
KOLONIETRANSFER
24
B.5.5.3.
SOUTHERN-BLOT
24
B.5.5.4.
NORTHEM-BLOT
24
B.5.6.
HYBRIDISIERUNG
VON
TRAEGERGEBUNDENEN
NUKLEINSAEUREN
24
B.5.6.
1.
REVERS
TRANSKRIBIERTE
RNA
ALS
SONDE
(
32
P)
24
B.5.6.2.
DNA
ALS
SONDE
(
32
P,
35
S,
DIG)
25
B.5.6.3.
32
P-MARKIERTE
OLIGONUKLEOTIDE
25
B.5.7.
PCR
25
B.5.7.1.
DNA
ALS
MATRIZE
25
B.5.7.2.
RT-PCR
26
B.5.8.
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
26
B.5.9.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRANG-DNA
27
B.5.
10.
PRIMER
EXTENSION
27
B.5.
11.
UNSPEZIFISCHE
FAERBUNG
VON
GEBLOTTETER
RNA
28
B.6.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
28
B.6.
1.
IDENTIFIKATION
UND
ANREICHERUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
28
B.6.1.1.
INDUKTION
UND
HERSTELLUNG
VON
HITZEEXTRAKTEN
28
B.6.
1.2.
FRAKTIONIERUNG
VON
LOESLICHEN
UND
UNLOESLICHEN
ZELLBESTANDTEILEN
28
B.6.
1.3.
REINIGUNG
UEBER
NICKELCHELATAGAROSE
29
B.6.1.4.
NACHREINIGUNG
UEBER
SUPERDEX
75
16/60
(FPLC)
29
B.6.
1.5.
DETEKTION
DES
"HIS-TAGS"
AUF
NYLONMEMBRAN
30
B.6.2.
RUECKFALTUNG
DENATURIERTER
PROTEINE
30
B.6.3.
WESTEM-BLOTTING
30
B.6.4.
DEGLYKOSILIERUNG
VON
PROTEINEN
31
B.6.4.1.
FLUORWASSERSTOFLBEHANDLUNG
31
B.6.4.2.
ENDOGLYKOSIDASE
F
VERDAU
31
B.6.5.
LYSOZYM-AKTIVITAETSTESTS
31
B.6.5.1.
TURBIDIMETRIE
31
B.6.5.2.
IN-GEL
VERDAU
VON
M.
LYSODEIKTICUS
31
B.6.6.
CHITINASE
AKTIVITAETSTESTS
32
B.6.6
1.
KOLORIMETRISCHER
NACHWEIS
VON
N-ACETYLHEXOSAMINEN
32
B.6.6.2.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAFIE
32
B.6.6
3.
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAFIE
32
B.6.6.4.
IN-GEL
CHITINASETESTS
32
B.6.7.
BLOCKADE
DER
SH-GRUPPEN
MIT
JODACETAMID
33
B.7.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
33
B.7.
1.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
33
B.7.2.
IMMUNODETEKTION
VON
WESTEM-BLOTS
34
B.7.3.
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
INTAKTER
VOLVOX-SPHAEROIDE
34
B.8.
CHEMIKALIEN
34
B.9.
GERAETE
35
C.
ERGEBNISSE
37
C.
1.
SYNTHESE
DER
CDNA-BANK
37
C.2.
DIFFERENTIELLES
SCREENING
DER
CDNA-BANK
39
C.2.
1.
ERGEBNIS
DER
ERSTEN
HYBRIDISIERUNGSRUNDE
40
C.2.2.
ERGEBNIS
DER
ZWEITEN
HYBRIDISIERUNGSRUNDE
41
C.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
CDNAS
42
C.3.1
KINETIK
DER
TRANSKRIPTION
42
C.3.2.
SEXSPEZIFISCHE
VERTEILUNG
43
C.3.3.
ORT
DER
EXPRESSION
45
C.4.
SUCHE
NACH
VOLLAENGENKLONEN
46
C.5.
D-KLON
47
C.5.
1.
BESTIMMUNG
DER
SEQUENZ
47
C.5.2.
FESTLEGUNG
DES
N-TERMINUS'
48
C.5.3.
SEQUENZANALYSE
50
C.5.4.
EXPRESSION
IN
E.
COLI
55
C.5.4.
1.
SYSTEM
UND
KLONIERUNG
55
C.5.4.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
56
C.5.4.3.
RUECKFALTUNG
DES
GENPRODUKTS
D5
58
C.5.5.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
59
C.5.5.1.
IMMUNISIERUNG
MIT
DEM
N-TENNINALEN
PROTEINFRAGMENT
59
C.5.5.2.
IMMUNISIERUNG
MIT
DEM
GESAMTEN,
M-VITRO
GEFALTETEN
PROTEIN
60
C.5.5.3.
GUETE
DER
ANTIKOERPER
60
C.6.
CHARAKTERISIERUNG
DES
GENPRODUKTES
D
IN
VOLVOX
61
C.6.1.
LOKALISIERUNG
DES
PROTEINS
61
C.6.2.
VERGLEICH
VON
REKOMBINANTEM,
REKOMBINANT
RENATURIERTEM
UND
NATIVEM
PROTEIN
62
C.6.3.
IMMUNFLUORESZENZ
INTAKTER
VOLVOXSPHAEROIDE
64
C.6.4.
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
D-EXPRESSION
67
C.6.5.
GLYKOPROTEINNATUR
68
C.6.6.
UNTERSUCHUNGEN
AN
STERILEN
MUTANTEN
68
C.6.7.
FUNKTIONSUNTERSUCHUNGEN
69
C.6.7.1.
LYSOZYM-TESTS
69
C.6.7.2.
CHITINASE-ASSAYS
70
C.6.8.
ZN-VIVO-TESTS
76
C.7.
C-KLON
76
C.7.
1.
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA
UND
SEQUENZANALYSE
76
C.7.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
80
C.7.3.
REINIGUNG
VON
CAN98
UND
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
81
C.7.4.
LOKALISATION
DES
PROTEINS
IN
VOLVOX
82
D.
DISKUSSION
84
E.
ZUSAMMENFASSUNG
90
F.
ANHANG
92
F.
1.
PARTIALSEQUENZ
DES
A-KLONES
92
F.2.
MUTAGENESE
DES
SEXUALINDUKTORGENS
VON
V.CARTERI
92
F.2
.1.
AUSTAUSCH
EINZELNER
BASEN
92
F.2.2.
C-TERMINAL
VERKUERZTE
VARIANTEN
93
G.
LITERATURVERZEICHNIS
95 |
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