Klonierung und Charakterisierung des Cyclin-1-Promotors aus Saccharomyces cerevisiae:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGEN
VI
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
7
2.1.
BAKTERIEN
UND
HEFESTAEMME
.
7
2.2.
MATERIALIEN
.
8
2.2.1.
NAEHRMEDIEN
.
8
2.2.2.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
9
2.2.3.
ENZYME
.
10
2.2.4.
RADIOCHEMIKALIEN
.
10
2.2.5.
FEINCHEMIKALIEN
UND
KLEINMATERIAL
.
11
2.2.6.
GERAETE
.
12
2.3.
ALLGEMEINE
MOLEKULARE
KLONIERUNGSMETHODEN
.
13
2.3.1.
VERDAUUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
13
2.3.2.
AUFFUELLEN
VON
3'-ZURUECKLIEGENDEN
ENDEN
.
13
2.3.3.
ERZEUGUNG
VON
"STUMPFEN"
ENDEN
DURCH
NUKLEASEVERDAU
.
13
2.3.4.
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
14
2.3.5.
LIGATION
.
14
2.3.6.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
14
2.3.7.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
PRAEPARATIVEN
GELEN
.
15
2.3.7.I.
AGAROSE-GELE
.
15
2.3.7.2.
POLYACRYLAMID-GELE
.
15
2.3.8.
TRANSFORMATION
IN
E.
COLI
.
15
2.3.8.1.
CALCIUMCHLORID-METHODE
.
16
2.3.8.2.
RUBIDIUMCHLORID-METHODE
.
16
2.3.8.3.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
E.
COLI
.
16
II
2.3.9.
PLASMID-PRAEPARATION
AUS
E.
COLI
.
17
2.3.9.1.
MINI-PRAEPARATION
.
17
2.3.9.2.
MAXI-PRAEPARATION
.
17
2.4.
METHODEN
ZUR
ORTSSPEZIFISCHEN
MUTAGENESE
.
18
2.4.1.
ANZUCHT
DES
BAKTERIOPHAGEN
M13KO7
.
18
2.4.2.
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
18
2.4.3.
PHOSPHOROTHIOAT-METHODE
.
19
2.4.3.1.
"SELF-PRIMING"-TEST
.
19
2.4.3.2.
PHOSPHORYLIERUNG
DES
"MISMATCH"-OLIGONUKLEOTIDS
.
19
2.4.3.3.
PRAEPARATION
VON
RFIV-DNA
.
20
2.4.3.4.
"NICKING"-REAKTION
.
20
2.4.3.5.
"GAPPING'-REAKTION
.
21
2.4.3.OE.
REPOLYMERISATION
UND
TRANSFORMATION
.
21
2.5.
ALLGEMEINE
METHODEN
ZUM
ARBEITEN
MIT
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
22
2.5.1.
KREUZUNG
.
22
2.5.2.
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
.
22
2.5.3.
SPORULATION
.
22
2.5.4.
TETRADENANALYSE
.
22
2.5.5.
HEFE-TRANSFORMATION
.
23
2.5.6.
TEST
AUF
A-FAKTOR
SENSITIVITAET
.
23
2.5.7.
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
HEFE
.
24
2.5.8.
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFE
.
25
2.5.9.
SYNCHRONISATION
DURCH
PHEROMON
ARREST
.
26
2.5.10.
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
IN
HEFE
.
27
2.5.10.1.
KEMFAERBUNG
MIT
PROPIDIUMJODID
.
27
2.5.10.2.
ANFAERBUNG
DES
MITOTISCHEN
SPINDELAPPARATES
.
27
NI
2.6.
HYBRIDISIERUNGSMETHODEN
.
28
2.6.1.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
28
2.6.1.1.
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
28
2.6.1.2.
PRAEPARATIOEN
VON
MASTER
UND
REPLIKAFILTEM
.
29
2.6.I.3.
HYBRIDISIERUNGS
UND
WASCHBEDINGUNGEN
.
29
2.6.2.
DIREKTE
GELHYBRIDISIERUNG
VON
DNA
.
30
2.6.2.1.
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
STARTER-VERLAENGERUNG
.
30
2.6.2.2.
HYBRIDISIERUNGS
UND
WASCHBEDINGUNGEN
.
30
2.6.3.
NORTHERN-ANALYSE
.
32
2.6.3.1.
RNA-GEL
UND
TRANSFER
.
32
2.6.3.2.
HYBRIDISIERUNGS
UND
WASCHBEDINGUNGEN
.
33
2.7.
SEQUENZIERUNG
NACH
SANGER
.
33
2.7.1.
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
.
33
2.7.2.
ANLAGERUNG
DES
DNA-STARTERMOLEKUELS
.
34
2.7.3.
MARKIERUNGSREAKTION
.
34
2.7.4.
KETTENABBRUCHREAKTION
.
35
2.8.
MESSUNG
DER
EXPRESSION
MIT
LUZIFERASE
ALS
REPORTERGEN
.
35
2.8.1.
ANZUCHT
DER
TRANSFORMANTEN
.
36
2.8.2.
ZELLAUFSCHLUSS
UND
MESSUNG
DER
LUZIFERASE-EXPRESSION
.
36
2.9.
PROTEINBESTIMMUNG
.
37
IV
3.
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
.
38
3.1.
ISOLIERUNG
DER
CLNI-GENREGION
.
38
3.1.1.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
38
3.1.2.
IDENTIFIZIERUNG
POSITIVER
KLONE
DURCH
DIREKTE
GELHYBRIDISIERUNG
.
39
3.1.3.
HERSTELLUNG
EINER
SUBGENOMISCHEN
BANK
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
42
3.1.4.
KARTIERUNG
DES
CLN1
PROMOTERS
.
44
3.1.5.
SEQUENZIERUNG
DES
CLNI-PROMOTERS
.
47
3.2.
IDENTIFIZIERUNG
ESSENTIELLER
REGULATORISCHER
REGIONEN
DES
CLN1
PROMOTORS
DURCH
VERWENDUNG
VON
LUZIFERASE
ALS
REPORTER-GEN
.
49
3.2.1.
MUTAGENISIERUNG
AM
START
DES
CLNI-GENS
.
49
3.2.2.
SEQUENZIERUNG
DER
MUTAGENISIERTEN
REGION
.
50
3.2.3.
KONSTRUKTION
DES
LUZIFERASE
SYSTEMS
.
51
3.2.4.
KONSTRUKTION
DER
DELETIONSMUTANTEN
.
54
3.2.5.
BESTIMMUNG
DER
LUZIFERASE-AKTIVITAET
IN
ABHAENGIGKEIT
DER
VERSCHIEDENEN
CLNI-PROMOTORVARIATIONEN
.
54
3.3.
BETIMMUNG
VON
GESAMTAKTIVITAET
UND
PHEROMON-REPRIMIERBARKEIT
DER
CLNI-PROMOTORVARIANTEN
DURCH
MESSUNG
DER
TRANSKRIPTIONSRATE
.
56
3.3.1.
KONSTRUKTION
DES
"LIN"-SYSTEMS
.
58
3.3.2.
GESAMTAKTIVITAET
UND
PHEROMON-REPRIMIERBARKEIT
DER
VERSCHIEDENEN
PROMOTORKONSTRUKTE
.
59
3.4.
UNTERSUCHUNG
DER
DURCH
DIE
VERSCHIEDENEN
PROMOTORKONSTRUKTE
INDUZIERTEN
LIN
1
-EXPRESSION
IM
VERLAUFE
DES
ZELLZYKLUS
.
63
3.4.1.
SYNCHRONISATION
DURCH
PHEROMON
.
63
3.4.2.
UNTERSUCHUNG
DER
IN
ABHAENGIGKEIT
UNTERSCHIEDLICHER
CLN1
PROMOTORKONSTRUKTE
INDUZIERTEN
LIN
1
-EXPRESSION
IM
VERLAUFE
DES
ZELLZYKLUS
.
66
3.5.
UNTERSUCHUNG
DES
ZELLZYKLUSSPEZIFISCHEN
ABBAUS
DER
LINL-MRNA
.
69
V
3.6.
AUFBAU
EINES
SYSTEMS
ZUR
SELEKTION
VON
KOMPONENTEN
DES
PHEROMON
SIGNALTRANSDUKTIONSWEGES
.
71
3.6.1.
KONSTRUKTION
EINES
ADCI-PROMOTOR-KONTROLLIERTEN
CLNL-GENS
.
72
3.6.2.
ERMITTLUNG
DER
ADCI-PROMOTOR
-INDUZIERTEN
CLN1
TRANSKRIPTIONSINTENSITAET
.
75
3.6.3.
TEST
DER
EINZELNEN
STAEMME
AUF
PHEROMON-SENSITIVITAET
.
76
3.6.4.
KONSTRUKTION
EINES
CLNL-PROMOTOR
KONTROLLIERTEN
URA3-GENS
.
78
3.6.5.
ERMITTLUNG
DER
FUER
EINE
WACHSTUMSINHIBITION
OPTIMALEN
5-FLUOR
OROTSAEUREKONZENTRATION
.
80
4.
DISKUSSION
.
83
4.1.
ISOLIERUNG
DER
CLN1-GENREGION
.
83
4.2.
DELETIONSANALYSE
DES
CLN1-PROMOTORS
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
AKTIVIERENDER
REGIONEN
.
83
4.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
AN
DER
PHEROMON-REPRESSION
BETEILIGTEN
PROMOTORELEMENTE
.
92
4.4.
UNTERSUCHUNG
DER
VON
DEN
VERSCHIEDENEN
PROMOTORKONSTRUKTEN
ABHAENGIGEN
LIN
1
-EXPRESSION
IM
VERLAUF
DES
ZELLZYKLUS
.
95
4.5.
AUFBAU
EINES
SELEKTIONSSYSTEMS
ZUR
ISOLIERUNG
VON
KOMPONENTEN
DES
PHEROMON-SIGNALTRANSDUKTIONSWEGES
.
99
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
106
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
108 |
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