Untersuchungen zur Expression des Auxin-Bindungsproteins (ABP) aus Mais (Zea mays L.):
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1994
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VERZEICHNISSE
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 1
TABELLENVERZEICHNIS 2
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 3
1
EINLEITUNG 5
1.1 AUXIN 5
1.2 DAS WIRKUNGSPRINZIP DER AUXINE 5
1.3 DIE SUCHE NACH AUXINREZEPTOREN 6
1.3.1 LOESLICHE AUXINBINDENDE PROTEINE (SABPS) 7
1.3.2 MEMBRANSTAENDIGE AUXINBINDENDE PROTEINE 7
1.4 ABP: DAS
SITE
/-PROTEIN AUS MAIS 8
1.4.1 BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN DES ABP 8
1.4.2 REZEPTORFUNKTION DES ABP 8
1.4.3 ABP IN ANDEREN PFLANZEN 9
1.4.4 MODELLE ZUM ZUSAMMENSPIEL VON AUXIN UND ABP 10
1.5 DIE AUXIN-SIGNALKETTE 12
1.6 ZIEL DER ARBEIT 13
2 MATERIAL 14
2.1 BIOLOGISCHES MATERIAL 14
MAIS 14
BAKTERIENSTAEMME 14
PLASMIDE 14
2.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 14
2.3 GERAETE 16
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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VERZEICHNISSE
3 METHODEN 17
3.1 ANZUCHT DER MAISKEIMLINGE 17
3.2 NUKLEINSAEURETECHNIKEN 17
3.2.1 PLASMIDMANIPULATIONEN 17
ISOLIERUNG 17
RESTRIKTION 17
LIGATION 18
AUFFUELLEN VON 5'-UEBERHAENGENDEN DNA-ENDEN
(COBIANCHI & WILSON, 1987) 18
3.2.2 ELEKTROPHORESE 18
3.2.2.1 FLACHBETTGELELEKTROPHORESE VON DNA
(MANIATISETAL., 1982) 18
3.2.2.2 FLACHBETTGELELEKTROPHORESE VON RNA
(MANIATISETAL., 1982) 18
3 2.2.3 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE VON RNA 18
3.2.3 ELEKTROELUTION 19
3.2.4 KOMPETENTE BAKTERIEN UND TRANSFORMATION:
(CHUNG & MILLER, 1988) 19
3.2.5 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA (CHOMCZYNSKI & SACCHI, 1987) 20
3.2.6 SYNTHESE VON HYBRIDISIERUNGSSONDEN 20
3.2.6.1 MARKIERTE RNA DURCH RUN-OFF-TRANSKRIPTION 20
3.2.6.2 MARKIERTE DNA MIT DIGOXIGENIN-11-DUTP 20
3.2.6.3 MARKIERTE DNA-OLIGOS DURCH TAILING MIT DIGOXIGENIN-11-
DUTP 21
3.2.7 BLOTVERFAHREN: IMMOBILISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUF
MEMBRANEN 22
3.2.7.1 DOTBLOT (CHAN ET AL., 1985) 22
3.2.72 NORTHEMBLOT 22
3.2.7.3 SOUTHEMBLOT (SOUTHERN, 1975; REED & MANN, 1985) 22
3.2.7.4 BLOTHYBRIDISIERUNGEN 22
3.2.7.5 DETEKTION DER SONDEN 23
3.2.8
IN SITU HYBRIDISIERUNGEN 24
3.2.8.1 VORBEHANDLUNG DER OBJEKTTRAEGER UND DECKGLAESER 24
3.2.8 2 FIXIEREN, EINBETTEN, SCHNEIDEN 24
3.2.8.3 NICHTRADIOAKTIVE
IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT BIO-SONDEN
(BRESSER & EVINGER-HODGESS, 1987) 25
VERZEICHNISSE
III
3.2.8 4 NICHTRADIOAKTIVE
IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT DIG-SONDEN
(CEPHALON INC.) 25
3.2.8.5 RADIOAKTIVE
IN SITU HYBRIDISIERUNG
(SCHMELZER, LABORPROTOKOLL) 26
3.2.8.6 RADIOAKTIVE
IN SITU HYBRIDISIERUNG
(MEYEROWITZ, 1987; SMITH ET AL., 1987) 28
3.2.9 RNA-TITRATION (LEE UND COSTLOW, 1987) 30
3.3 PROTEINTECHNIKEN 31
3.3.1 PROTEINBESTIMMUNG 31
3.3.2 PROTEINROHEXTRAKTE 31
3.3.3 POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE (PAGE) 32
3.3.4 IMMUNOWESTEMBLOT 32
4 ERGEBNISSE 34
4.1 KONSTRUKTION VON TRANSKRIPTIONSPLASMIDEN 34
4.2 NICHTRADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNGSSONDEN 34
4.2.1 SONDENTYPEN 34
4.2.2 SENSITIVITAET 35
4.2.3 SPEZIFITAET 35
4.2.4 NORTHEMHYBRIDISIERUNG 35
4.2.5
IN SITU HYBRIDISIERUNG 39
4.3 RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNGSSONDEN 42
4.3.1 RADIOAKTIVE
IN SITU HYBRIDISIERUNGEN 42
4.3.2 RADIOAKTIVE NORTHEMEXPERIMENTE 48
4.3.2.1 ABP-MRNA IN VERSCHIEDENEN ORGANEN DES
MAISKEIMLINGS 48
4.3.22 ZEITREIHEN 49
4.3.2.3 ABP-MRNA-VERTEILUNG ENTLANG DER KOLEOPTILLAENGSACHSE 51
4.3.2 4 ABP-MRNA-VERTEILUNG ZWISCHEN EPIDERMIS UND
GESCHAELTER KOLEOPTILE 52
4.3.3 RNA-TITRATIONSASSAY 53
4.4 IMMUNO-WESTEMBLOTS 55
4.4.1 QUALITATIVER NACHWEIS VON ABP IM MAISKEIMLING 55
4.4.2 HALBQUANTITATIVER NACHWEIS VON ABP IN EPIDERMIS UND
GESCHAELTER KOLEOPTILE 56
VERZEICHNISSE
_
4.4.3 HALBQUANTITATIVER NACHWEIS VON ABP IN DER
MESOKOTYLEPIDERMIS UND DEM GESCHAELTEN MESOKOTYL 58
4.4.4 VERTIKALE VERTEILUNG DES ABP IN DER KOLEOPTILE 59
5 DISKUSSION 61
5.1 NICHT RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE 62
5.2 RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG 63
5.2.1
IN SITU HYBRIDISIERUNG 63
5.2.2 ABP-MRNA IN DEN KOLEOPTILGEWEBEN 63
5.2.3 ABP-MRNA ZEITREIHEN 64
5.2.4 ABP-MRNA-VERTEILUNG ENTLANG DER KOLEOPTILLAENGSACHSE 65
5.2.5 RNA-TITRATIONSASSAY 65
5.3 IMMUNOWESTEMBLOTTING 66
5.3.1 ABP IM MAISKEIMLING 66
5.3.2 ABP-VERTEILUNG ZWISCHEN EPIDERMIS UND INNEREN GEWEBEN 67
5.4 ZUR SPEZIFITAET DER VERWENDETEN SONDEN 69
5.4.1 WAS WIRD MIT ABP-ANTIKOERPEM NACHGEWIESEN? 69
5.4.2 WAS WIRD MIT DEN HYBRIDISIERUNGSSONDEN NACHGEWIESEN? 70
5.5 ABP UND AUXINSENSITIVITAET 71
6 ZUSAMMENFASSUNG: 74
7 LITERATURVERZEICHNIS: 75
DANKSAGUNG: 67
LEBENSLAUF: 88
ERKLAERUNG: 89 |
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