Entwicklung einer generellen Methode zur Mutagenese von Neisseria gonorrhoeae: Charakterisierung von invasionsdefizienten Mutanten
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
3
2.1
INVASION
VON
YERSINIA
ARTEN
3
2.2
INVASION
VON
ENTEROPATHOGENEN
E.COLI
(EPEQ
4
2.3
INVASION
VON
SALMONELLA-AITEN
5
2.4
INVASION
VON
SHIGELLA
FLEXNERI
6
2.5
INVASION
VON
USTERIA
MONOCYTOGENES
-
7
2.6
INVASION
VON
NEISSERIA
GONORRHOEAE
7
2.7
MOLEKULARBIOLOGISCHES
ARBEITEN
MIT
N.GONORRHOEAE
11
2.8
DASTRANSPOSONTN/727
13
2.9
ZIELSTELLUNGEN
DER
ARBEIT
14
3
ERGEBNISSE
15
3.1
KONZEPTION
DES
TNAFAX-SYSTEMS
15
3.1.1
KONSTRUKTION
VON
PTNMAXL
15
3.1.2
KONSTRUKTION
VON
PTNMAX2
17
3.1.3
KONSTRUKTION
VON
PTNMAX?
18
3.1.4
KONSTRUKTION
VON
PTNMAX4
20
3.1.5
KONSTRUKTION
VON
PTNA/ ZX5
22
3.1.6
PRINZIP
DER
TRANSPOSONMUTAGENESE
23
3.1.7
BESTIMMUNG
DER
TRANSPOSITIONSFREQUENZ
24
3.1.8
KONSTRUKTION
EINES
MINIMALPLASMIDES
ZUR
OPTIMIERUNG
DER
25
TRANSPOSONMUTAGENESE
3.2
SHUTTLE-MUTAGENESE
27
3.2.1
S/TUTT/E-MUTAGENESE
VON
N.GONORRHOEAE
27
3.3
IDENTIFIKATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
INVASIONSDEFEKTEN
MUTANTEN
28
3.3.1
IDENTIFIKATION
VON
INVASIONSDEFEKTEN
MUTANTEN
28
3.3.2
MUTATIONEN
IN
DEN
STAEMMEN
N286
UND
N393
30
3.3.3
PHYSIKALISCHE
ANALYSE
DER
INVASIONSDEFEKTEN
MUTANTEN
32
3.3.4
IDENTIFIZIERUNG
DER
REGIONEN
OBERHALB
DER
PHOA
'-SEQUENZ
DER
36
TNAFAX4-INSERTIONEN
3.3.5
PHASENVARIATION
DER
INVASIONSDEFIZIENTEN
MUTANTEN
40
3.3.6
VORKOMMEN
DER
INVASIONSDETERMINANTEN
IN
PATHOGENEN
NEISSERIEN
41
UND
KOMMENSALEN
3.3.7
ROLLE
DES
PILB-PROTEINS
IN
DER
INVASION
42
3.3.7.1
ANALYSE
DER
INVASIONSDEFIZIENZ
VON
PI/SS-MUTANTEN
42
3.3.7.2
BEDEUTUNG
DES
PILB-PROTEINS
FUER
DIE
EPITHELZELLINDUZIERTE
RELAXIERUNG
45
DES
KRYPTISCHEN
PLASMIDS
VON
N.GONORRHOEAE
3.3.8
ROLLE
DES
PORA-PROTEINS
IN
DER
INVASION
47
3.3.8.1
KLONIERUNG
UND
GENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
POM-GENS
VON
N.GONORRHOEAE
47
3.3.8.2
SEQUENZIERUNG
DES
POM-GENS
AUF
PAFK17
47
3.3.8.3
SEQUENZVERGLEICH
DES
PORA-PROTEINS
VON
GONOKOKKEN
MIT
PORA
PROTEINEN
VON
MENINGOKOKKEN
48
3.3.8.4
ANALYSE
DER
INVASIONSDEFIZIENZ
VON
PORA-MUTANTEN
54
3.3.9
ANALYSE
DER
INVASIONSDEFIZIENZ
VON
OR/738-MUTANTEN
55
3.4
BEDEUTUNG
DES
PILC-PROTEINS
FUER
DIE
INVASION
57
3.4.1
INVASION
VON
PI/C-MUTANTEN
57
3.4.2
KOMPLEMENTATIONSSTRATEGIE
1:
KONSTRUKTION
EINES
STAMMES,
DER
DAS
INVASIONSVERMITTELNDE
OPA-PROTEIN
UEBERPRODUZIERT
59
3.4.3
KOMPLEMENTATIONSSTRATEGIE
2:
KOPROPAGATION
ZWEIER
HETEROLOGER
PTETAF-PLASMIDE
IN
EINEM
GONOKOKKENSTAMM
62
3.4.4
KOMPLEMENTATIONSSTRATEGIE
3:
KONSTRUKTION
EINES
PTETM-PLASMIDS
MIT
DEM
OPAJO
UND
EINEM
PILC
-GEN
65
3.5
EINFLUSS
DER
GYRASE
AUF
DIE
INVASION
67
3.5.1
EINFLUSS
EINER
GYRSS-MUTATION
AUF
DIE
INVASION
67
3.5.2
EINFLUSS
DER
GYRB-MUTATION
AUF
DIE
SUPERHELIZITAET
DES
KRYPTISCHEN
PLASMIDS
69
3.5.3
EINFLUSS
DER
GYRSS-MUTATION
AUF
DIE
DURCH
N.GONORRHOEAE
INDUZIERTE
AKTINAKKUMULATION
IN
EPITHELZELLEN
69
4
DISKUSSION
71
4.1
DAS
TNAFAR-SYSTEM
71
4.2
S/IUTT/E-MUTAGENESE
VON
NEISSERIA
GONORRHOEAE
73
4.3
IDENTIFIKATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
INVASIONSDEFIZIENTEN
MUTANTEN
75
4.4
BEDEUTUNG
DES
PILB-PROTEINS
FUER
DIE
INVASION
82
4.5
PORA-EIN
NEUES
PORIN
VON
N.GONORRHOEAE
84
4.6
ORFL38
IST
EIN
INVASIONSFAKTOR
VON
GONOKOKKEN
85
4.7
PILC
IST
EIN
INVASIONSFAKTOR
VON
N.GONORRHOEAE
86
4.8
BEDEUTUNG
DER
GYRASE
FUER
DIE
INVASION
87
4.9
AUSBLICK
88
5
MATERIAL
UND
METHODEN
89
5.1
MATERIAL
89
5.1.1
ESCHERICHIA
CO/I-STAEMME
89
5.1.2
NEISSERIA
GONORRHOEAE-STAEMME
89
5.1.3
PLASMIDE
91
5.1.4
BAKTERIOPHAGEN
96
5.1.5
OLIGONUKLEOTIDE
96
5.1.6
MEDIEN
UND
PLATTEN
97
5.1.7
ANTIBIOTIKA
98
5.1.8
PUFFER
UND
LOESUNGEN
98
5.1.9
CHEMIKALIEN
101
5.1.10
ENZYME,
PROTEINE,
ZELLEN
UND
ANTISEREN
102
5.1.11
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
103
5.2
METHODEN
103
5.2.1
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E.COLI
NACH
DER
KOCHMETHODE
103
5.2.2
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E.COLI
NACH
DER
ALKALISCHEN
104
LYSEMETHODE
5.2.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
MIT
QUIAGEN-SAEULEN
TYP
104
100
5.2.4
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
NEISSERIA
GONORRHOEAE
105
5.2.5
ISOLIERUNG
DES
KRYPTISCHEN
PLASMIDS
AUS
N.GONORRHOEAE
MSI
1
105
5.2.6
ISOLIERUNG
DES
KRYPTISCHEN
PLASMIDS
AUS
AN
CHANG-ZELLEN
106
ADHAERIERENDEN
GONOKOKKEN
5.2.7
KONSTRUKTION
VON
E.CO/I
E145
106
5.2.8
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
107
5.2.9
DNA-FRAGMENTISOLIERUNG
107
5.2.10
KLONIERUNG
VON
DNA
108
5.2.11
ENTFERNUNG
VON
SALZEN
109
5.2.12
TRANSPOSONMUTAGENESE
110
5.2.13
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
110
5.2.14
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
HEXAMER-PRIMER
111
5.2.15
HYBRIDISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
112
5.2.16
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.COLI-ZEUEN
113
5.2.17
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.CO/I-ZELLEN
114
5.2.18
ELEKTROPORATION
VON
E.COLI
115
5.2.19
DNA-TRANSFER
IN
N.GONORRHOEAE
115
5.2.20
HERSTELLUNG
VON
BAKTERIELLEN
LYSATEN
116
5.2.21
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
116
5.2.21
WESTERNBLOT
116
5.2.22
KULTUR
VON
HUMANEN
EPITHELZELLEN
117
5.2.23
GENTAMICINVERSUCH
117
5.2.24
KRISTALLVIOLETTVERSUCH
118
5.2.25
DOPPELFLUORESZENZFAERBUNG
VON
BAKTERIEN
UND
AKTINFILAMENTEN
118
5.2.26
AUSWERTUNG
DER
DOPPELFLUORESZENZPRAEPARATE
MIT
DEM
KONFOKALEN
119
SCANNING-MIKROSKOP
6
LITERATURVERZEICHNIS
120
ABKUERZUNGEN
131 |
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