Untersuchungen zur heterologen Genexpression der Humanen Leukozyten-Elastase im Baculovirus-Expressionsvektor-System:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
A
B
1
2
2.1
2.2
2.3
2.4
3
3.1
3.2
3.3
4
C
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
2
.
2.1
2.1.1
2
.
1.2
2.2
2.3
2.4
2.5
2.5.1
2.5.2
2.5.3
2.6
2
.
6.1
2
.
6.2
2.6.3
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG.
EINLEITUNG.
FUNKTION UND REGULATION VON PROTEOLYTISCHEN ENZYMEN.
DIE HUMANE LEUKOZYTEN-ELASTASE.
FUNKTION DER HUMANEN LEUKOZYTEN-ELASTASE IM ORGANISMUS
CHEMISCHE UND BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN.
BIOLOGISCHE UND MEDIZINISCHE ASPEKTE.
DIE ROLLE VON MEDULLASIN IN ENTZUENDLICHEN PROZESSEN.
DAS BACULOVIRUS-EXPRESSIONSVEKTOR-SYSTEM (BEVS).
DER BACULOVIRUS-LEBENSZYKLUS.
KONSTRUKTION VON TRANSFERVEKTOREN.
MOEGLICHKEITEN UND GRENZEN DES BEVS.
PROBLEMSTELLUNG.
MATERIALIEN UND METHODEN.
MATERIALIEN.
MATERIALIEN UND BEZUGSQUELLEN.
HAEUFIG VERWENDETE PUFFER UND MEDIEN.
BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE.
VERWENDETE ZELLINIE.
DNA-LAENGENSTANDARD.
RNA-LAENGENSTANDARD.
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD.
METHODEN.
STERILISATION VON LOESUNGEN UND GERAETEN.
ARBEITEN MIT DNA.
ARBEITEN MIT RNA.
KULTIVIERUNG VON
E. COLI
UND ANLEGEN VON DAUERKULTUREN.
ABSORPTIONSMESSUNGEN.
AUTORADIOGRAPHIE.
PRAEPARATION VON PLASMID-DNA.
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG.
PRAEPARATIVE PLASMIDISOLIERUNG.
PLASMIDISOLIERUNG NACH QUIAGEN.
REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN.
PHENOLISIERUNG UND ETHANOLFAELLUNG.
ISOPROPANOLFAELLUNG.
CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.
1
3
3
4
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25
25
26
26
26
26
26
26
27
27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/942171365
2.7 GELELEKTROPHORESE VON DNA. 27
2.7.1 AGAROSEGELE. 27
2.7.2 POLYACRYLAMIDGELE. 28
2.7.3 SEQUENZIERGELE. 28
2.8 GELELEKTROPHORESE VON RNA. 28
2.8.1 TBE-GELE. 28
2.8.2 GLYOXAL-GELE.;. 29
2.9 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSE- UND POLYACRYLAMIDGELEN.
29
2.9.1 ELEKTROELUTION MIT DER BIOTRAP-APPARATUR. 29
2.9.2 ISOTACHOPHORESE. 30
2.10 ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN VON DNA. 30
2.10.1 HYDROLYSE MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN. 30
2.10.2 5'-DEPHOSPHORYLIERUNG. 31
2.10.3 5'-PHOSPHORYLIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN. 31
2.10.4 ASSOZIATION VON ZWEI OLIGONUKLEOTIDEN (ANNEALING). 31
2.10.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN. 31
2.10.6 GLAETTUNG KOHAESIVER ENDEN (FILL IN). 32
2.10.7 DIGOXIGENIN-MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN. 32
2.10.8 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN (RANDOM PRIMING). 32
2.11 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER E. COLI -ZELLEN. 33
2.11.1 PRAEPARATION NACH HANAHAN. 33
2.11.2 PRAEPARATION NACH DER CACYRBCLJ-METHODE. 33
2.11.3 PRAEPARATION NACH DER CACLJ-METHODE. 34
2.12 TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI -ZELLEN. 34
2.13 SEQUENZIERUNG VON DNA. 34
2.14 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 35
2.15 KULTIVIERUNG VON IRISEKTENZELLEN (SF9-ZELLEN). 37
2.15.1 VERWENDETE KULTURMEDIEN. 37
2.15.2 SUBKULTIVIERUNG VON SF9-ZELLEN. 37
2.15.3 BESTIMMUNG VON ZELLDICHTE UND GENERATIONSDAUER. 38
2.15.4 BESTIMMUNG DER LEBENSFAEHIGKEIT. 38
2.15.5 ANLEGEN UND AUFTAUEN VON DAUERKULTUREN. 39
2.16 INFEKTION VON SF9-ZELLEN. 39
2.16.1 INFEKTION ZUR VIRUSVERMEHRUNG. 39
2.16.2 INFEKTION ZUR DNA- UND RNA-ISOLIERUNG. 40
2.16.3 BESTIMMUNG DES VIRUSTITERS. 41
2.16.4 EXPRESSION EINES REKOMBINANTEN PROTEINS IN TC-100 KOMPLETTMEDIUM
UND SF-900-UE MEDIUM.
41
2.17 ISOLIERUNG VIRALER DNA AUS EXTRAZELLULAEREN VIRUSPARTIKELN (ECV). 42
2.18 HERSTELLUNG UND ISOLIERUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN. 42
2.18.1 COTRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN. 43
2.18.2 LIMITIERTE VERDUENNUNG ZUR IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN.
2.18.3 DNA-DOT-BLOT ZUM NACHWEIS REKOMBINANTER BACULOVIREN.
2.18.4 HYBRIDISIERUNG MIT DIGOXIGENIN-MARKIERTEN DNA-SONDEN.
2.19 AUFSCHLUSS INFIZIERTER SF9-ZELLEN.
2.19.1 ULTRASCHALLAUFSCHLUSS.
2.19.2 AUFSCHLUSS DURCH EINFRIEREN UND AUFTAUEN.
2.20 RNA-ISOLIERUNG AUS SF9-ZELLEN.
2.21 NORTHEM-BLOT-ANALYSE.
2.21.1 KAPILLARBLOT.
2.21.2 HYBRIDISIERUNG UND WASCHEN.
2.22 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINLOESUNGEN.
2.22.1 METHODE NACH BRADFORD.
2.22.2 BCA-METHODE.
2.22.3 MESSSUNG BEI AM .
2.23 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN DURCH ULTRAFILTRATION.
2.24 DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
2.25 NACHWEIS VON PROTEINEN DURCH SILBERFAERBUNG.
2.26 TRANSFER UND IMMOBILISIERUNG VON PROTEINEN.
2.26.1 SEMI-DRY-BLOT-VERFAHREN.
2.26.2 WET-BLOT-VERFAHREN.
2.26.3 PROTEIN-DOT-BLOT.
2.27 NACHWEIS FILTERGEBUNDENER PROTEINE.
2.27.1 FAERBUNG MIT PONGEAU .
2.27.2 FAERBUNG MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE.
2.27.3 FAERBUNG MIT INDIA-INK.
2.27.4 DENATURIERUNG/RENAWIERUNG FILTERGEBUNDENER PROTEINE.
2.27.5 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS BEI WESTEM-BLOTS.
2.27.6 IMMUNCHEMISCHER NACHWEIS BEI PROTEIN-DOT-BLOTS.
2.28 REINIGUNG VON PROTEINEN.
2.28.1 NIEDRIGSALZDIALYSE.
2.28.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN APROTININ-AGAROSE.
2.29 AKTIVITAETSTEST FUER DIE HUMANE LEUKOZYTEN-ELASTASE.
D ERGEBNISSE.*.
1 KONSTRUKTION DER TRANSFERPLASMIDE PVLSM5 (II 2-HLE-ASP
88) UND
PVLSM6 (II 2-HLE-ASN
88).
1.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE.
1.2 KONSTRUKTION DES ZWISCHENPLASMIDS PVLIL2.
1.3 KONSTRUKTION DER TRANSFERPLASMIDE PVLSM5 UND PVLSM6 .
1.4 SEQUENZIERUNG DER TRANSFERPLASMIDE PVLSM5 UND PVLSM6 .
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53
53
53
54
55
56
. 56
. 56
. 59
. 60
. 63
ISOLIERUNG VIRALER DNA AUS EXTRAZELLULAEREN VIRUSPARTIKELN (ECV)
ACMNPV INFIZIERTER ZELLEN.
HERSTELLUNG REKOMBINANTER BACULOVIREN DURCH COTRANSFEKTION VON
SF9-ZELLEN.
OPTIMIERUNG DES TRANSFEKTIONSPUFFERS.
COTRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN.
ISOLIERUNG DER REKOMBINANTEN BACULOVIREN FL, F4, F6, G12 (II
2-HLE-ASP88)
UND F5, F7, FL 1, G4 (II 2-HLE-ASN88).
PRAEPARATION DER DIGOXIGENIN-MARKIERTEN SONDE.
LIMITIERTE VERDUENNUNG DES TRANSFEKTIONSUEBERSTANDES UND DNA-
DOT-BLOT-HYBRIDISIEMNG.
VERMEHRUNG DER REKOMBINANTEN VIREN UND TITERBESTIMMUNG.
NACHWEIS DER II 2-HLE-GENINTEGRATION (D 2-HLE-ASP88 UND II 2-HLE-ASN8)
IN DAS ACMNPV-GENOM.
ISOLIERUNG VIRALER DNA AUS ECV DER REKOMBINANTEN BACULOVIREN.
POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) DER VIRALEN DNA MIT DEN PRIMERN
BV1, BV2, EL2 UND OBIO. YY
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72
73
SEQUENZANALYSE DER II 2-HLE-GENINTEGRATION DER REKOMBINANTEN BACULOVIREN
F6 (II 2-HLE-ASP
88) UND F5, FL 1 (II 2-HLE-ASN88). 76
KLONIERUNGSSTRATEGIE.
KONSTRUKTION VON PSKF6 (D 2-HLE-ASP
88) UND PSKF5, PSKFL 1
(H 2-HLE-ASN88). 76
SEQUENZIERUNG DER II 2-HLE-GENINTEGRATION IN PSKF6, PSKF5 UND PSKFL
1. 79
NACHWEIS DES II2-HLE SPEZIFISCHEN MRNA-TRANSKRIPTS DER
REKOMBINANTEN BACULOVIREN F5, F7, FL 1 UND G4 (H 2-HLE-ASN ). 81
PRAEPARATION DER RADIOAKTIV MARKIERTEN DNA-SONDE. 82
RNA-PRAEPARATION UND NORTHEM-BLOT-ANALYSEN VON F5 INFIZIERTEN
SF9-ZELLEN 6,12,24,48 UND 72 H .
5Z
RNA-PRAEPARATION UND NORTHEM-BLOT-ANALYSEN VON F5, F7, FL 1 UND
G4 INFIZIERTEN SF9-ZELLEN 72 H P.I.
UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER REKOMBINANTEN PRON-PROC-HLE
(ASP
88- UND ASN88-GENVARIANTE).
EXPRESSION IN TC-100 KOMPLETTMEDIUM UND SF-900 D MEDIUM.
NACHWEIS DER REKOMBINANTEN PRON-PROC-HLE IM KULTURUEBERSTAND
NACH ULTRAFILTRATION.
NACHWEIS DER REKOMBINANTEN PRON-PROC-HLE IM KULTURUEBERSTAND
NACH NIEDRIGSALZDIALYSE.
NACHWEIS DER REKOMBINANTEN PRON-PROC-HLE IM ZELLEXTRAKT UND
ZELLSEDIMENT NACH NIEDNGSALZDIALYSE.
PRAEPARATIVE EXPRESSION UND REINIGUNG DURCH NIEDRIGSALZDIALYSE
UND AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.
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87
88
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93
100
102
DISKUSSION.
LITERATURVERZEICHNIS.
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