Die Analyse von Markerchromosomen mit Hilfe der Reversen Fluoreszenz In-situ-Hybridisierung:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
PROTOKOLL-, ABBILDUNGS-, TABELLEN VERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1 EINLEITUNG 1
2 STAND DER FORSCHUNG 4
2.1 MIKROSEZIERUNG UND MIKROKLONIERUNG VON CHROMOSOMEN 4
2.1.1 RIESENCHROMOSOMEN VON DROSOPHILA MELANOGASTER 4
2.1.2 SAEUGERCHROMOSOMEN 5
2.1.3 VERBESSERTE TECHNIK DER MIKROSEZIERUNG UND -KLONIERUNG MITTELS PCR
6
UND GTG-BAENDERUNG
2.1.4 MIKROSEZIERUNG MIT LASER-TECHNIK 8
2.1.5 GEWONNENE MIKROSEZIERTE REGIONEN BEI GENETISCHEN ERKRANKUNGEN 9
2.1.6 MOEGLICHE ANWENDUNGSBEREICHE DER MIKROSEZIERUNG 10
2.2 HERKUNFTSANALYSE UND INTERPRETATION VON MARKERCHROMOSOMEN 11
2.2.1 DEFINITION, VORKOMMEN UND BEDEUTUNG 11
2.2.2 MOEGLICHE STRUKTUREN VON MARKERCHROMOSOMEN 12
2.2.3 ENTSTEHUNG VON MARKERCHROMOSOMEN 15
2.2.3.1 ENTSTEHUNG VON INV DUP-FORMATIONEN 15
2.2.3.2 ENTSTEHUNG VON RINGCHROMOSOMEN 18
2.2.4 VERWENDETE METHODEN UND STRATEGIEN ZUR ANALYSE VON MARKERCHROMO-
19
SOMEN
2.2.5 TRAEGER VON MARKERCHROMOSOMEN: KONSEQUENZEN UND WIRKUNG 20
2.2.5.1 EUCHROMATISCHE MARKERCHROMOSOMEN 20
2.2.5.2 HETEROCHROMATISCHE MARKERCHROMOSOMEN 22
2.3 DIE BETEILIGUNG VON SPEZIFISCHEN REPETITIVEN DNA-SEQUENZEN AM 23
CHROMOSOMENAUFBAU DES MENSCHEN
3 MATERIAL UND METHODEN 28
3.1 VERWENDETE GERAETE UND MATERIALIEN 28
3.1.1 GERAETE 28
3.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 28
3.2 ZELLMATERIAL 30
3.2.1 LYMPHOCYTEN 30
3.2.2 FIBROBLASTEN, EPITHELZELLEN 30
3.2.3 FRUCHTWASSERZELLEN 30
3.2.4 CHORIONZELLEN 30
3.3 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 30
3.3.1 LYMPHOCYTEN 30
3.3.2 FIBROBLASTEN, EPITHELZELLEN 30
3.3.3 FRUCHTWASSERZELLEN 31
3.3.4 CHORIONZELLEN 31
3.3.5 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLKULTUREN 31
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
3.4 KLASSISCHE CHROMOSOMENBAENDERUNGSTECHNIKEN 32
3.4.1 QFQ-BAENDERUNG 32
3.4.2 GTG-BAENDERUNG 33
3.4.3 RBA-BAENDERUNG 34
3.4.4 CBG-BAENDERUNG 35
3.4.5 NOR-FAERBUNG 36
3.4.6 DA/DAPI-FAERBUNG 37
3.5 NICHT RADIOAKTIVE IN SITU HYBRIDISIERUNG 39
3.5.1 PRAEPARATION VON METAPHASEN 40
3.5.2 LAGERUNG VON CHROMOSOMENPRAEPARATEN 40
3.5.3 VORBEHANDLUNG VON METAPHASEN 40
3.5.3.1 RNASE-VORBEHANDLUNG, PEPSINVERDAU 40
3.5.3.2 ESSIGSAEUREVORBEHANDLUNG 41
3.5.4 GENSONDEN (DNA-PROBEN) 42
3.5.4.1 VERWENDETE DNA-PROBEN 42
3.5.4.2 MARKIERUNG VON DNA-PROBEN 42
3.5.4.2.1 MARKIERUNG VON DNA-PROBEN MIT BIOTIN - YY 43
3.5.4.2.2 MARKIERUNG VON DNA-PROBEN MIT DIGOXIGENIN 45
3.5.4.2.3 DOPPELMARKIERUNG BIOTIN/DIGOXIGENIN 45
3.5.5 HYBRIDISIERUNG 46
3.5.6 NACHWEIS MARKIERTER DNA-PROBEN 47
3.5.6.1 NACHWEIS BIOTINMARKIERTER DNA-PROBEN 47
3.5.6.2 NACHWEIS DIGOXIGENINMARKIERTER DNA-PROBEN 50
3.5.6.3 DOPPELHYBRIDISIERUNGSNACHWEIS: BIOTIN-FITC, DIGOXIGENIN-TRITC 51
3.5.7 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG UND PHOTOGRAPHISCHE DARSTELLUNG 52
3.6 REVERSE FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG 53
3.6.1 VERWENDETES MATERIAL 53
3.6.2 PRAEPARATION VON METAPHASEN 53
3.6.3 LAGERUNG DER PRAEPARATE 54
3.6.4 GTG-BAENDERUNG FUER MIKROSEZIERUNG 54
3.6.5 TECHNISCHES EQUIPEMENT ZUR DURCHFUEHRUNG DER MIKROSEZIERUNG 55
3.6.5.1 INVERSES PHASENKONTRASTMIKROSKOP 55
3.6.5.2 MECHANISCHER UND HYDRAULISCHER MIKROMANIPULATOR 55
3.6.5.3 MIKROSEZIEMADELN 55
ANFERTIGUNG 55
SILIKONISIERUNG DER MIKROSEZIEMADELN 55
3.6.5.4 PETRISCHALE MIT AUSGESCHNITTENEM BODEN 57
3.6.6 VORSICHTSMASSNAHMEN ZUR VERMEIDUNG DER KONTAMINATION MIT FREMD-DNA
58
3.6.7 DURCHFUEHRUNG DER MIKROSEZIERUNG 58
3.6.8 IN VITRO AMPLIFIZIERUNG MIKROSEZIERTER DNA MITTELS DOP-PCR 59
3.6.8.1 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 61
REINIGUNG DES PCR-PRODUKTS UEBER CENTRICON 30-FIITER 61
REINIGUNG DES PCR-PRODUKTS UEBER QUIAQUICK SPIN-SAEULEN 61
3.6.8.2 BESTIMMUNG DER DNA-MENGE VON PCR-PRODUKTEN 62
3.6.9 LOKALISIERUNG VON DOP-PCR PROBEN MIT FISH 63
3.6.9.1 MARKIEMNG VON DOP-PCR-PROBEN MIT BIOTIN 63
3.6.9.1.1 FILTEMACHWEIS DER BIOTINYLIERUNG 63
3.6.9.2 HYBRIDISIERUNG VON PCR-PROBEN 64
3.6.9.3 DETEKTION BIOTINYLIERTER PCR-PROBEN 64
INHALTSVERZEICHNIS
III
4 UNTERSUCHUNGSKOLLEKTIV 65
4.1 MATERIAL, ALTER, INDIKATION 65
4.2 HERKUNFT DER CHROMOSOMENPRAEPARATE 68
5 ERGEBNISSE 69
5.1 REVERSE FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG 70
5.1.1 FIXIERUNG 70
5.1.2 UNGEFAERBTE GEGENUEBER GTG-GEBAENDERTEN CHROMOSOMEN 71
5.1.3 ALTER DER PRAEPARATE BEI DER ANALYSE 72
5.1.4 ANZAHL DER VERWENDETEN MARKERCHROMOSOMEN 72
5.1.5 GEWONNENE DNA-MENGE UND FRAGMENTLAENGE NACH DOP-PCR 73
5.1.6 AMPLIFIZIERUNG VON HETERO- BZW. EUCHROMATISCHEN REGIONEN 73
5.1.7 MIKROSEZIERTE FAELLE 73
5.2 DIE ANALYSE VON MARKERCHROMOSOMEN 85
5.2.1 UEBERZAEHLIGE MARKERCHROMOSOMEN ~ 85
5.2.1.1 CHROMOSOMALE HERKUNFT VON UEBERZAEHLIGEN MARKERCHROMOSOMEN 86
5.2.1.2 KASUISTIKEN 88
DERIVATE VON CHROMOSOM 3 88
DERIVATE VON CHROMOSOM 9 90
DERIVATE VON CHROMOSOM 12 92
DERIVATE VON CHROMOSOM 13/21 95
DERIVATE VON CHROMOSOM 14 98
DERIVATE VON CHROMOSOM 15 102
DERIVATE VON CHROMOSOM 18 115
DERIVATE VON CHROMOSOM 19 115
DERIVATE VON CHROMOSOM 20 116
DERIVATE VON CHROMOSOM 22 119
DERIVATE VON CHROMOSOM X 123
GEMISCHTE DERIVATE DER CHROMOSOM 11 UND 22 124
DERIVATE UNBEKANNTER HERKUNFT 125
5.2.1.3 DIE STRUKTURELLE ABLEITUNG VON UEBERZAEHLIGEN MARKERCHROMOSOMEN
128
DIE INTERCHROMOSOMALE VERTEILUNG DER VERSCHIEDENEN ABERRATIONSTYPEN 128
1. ISOCHROMOSOMEN 128
2. TRANSLOKATIONSPRODUKTE 129
3. RINGCHROMOSOMEN 130
4. DELETIONSDERIVATE 130
STUKTURANALYSE BEI UEBERZAEHLIGEN MARKERCHROMOSOMEN DES CHROMO- 131
SOMS 15
5.2.1.4 DAS VORKOMMEN UEBERZAEHLIGER MARKERCHROMOSOMEN IN ABHAENGIGKEIT 131
VOM ALTER DER MUTTER UND DES VATERS
5.2.1.5 DIE ELTERLICHE HERKUNFT UEBERZAEHLIGER FAMILIAERER
MARKERCHROMOSOMEN 133
5.2.1.6 KARYOTYP-PHAENOTYP KORRELATION VON TRAEGEM MIT UEBERZAEHLIGEN 134
MARKERCHROMOSOMEN
TRAEGER HETEROCHROMATISCHER MARKERCHROMOSOMEN 134
TRAEGER EUCHROMATISCHER MARKERCHROMOSOMEN 135
5.2.1.7 DIE BEDEUTUNG UEBERZAEHLIGER HETEROCHROMATISCHER MARKERCHROMOSOMEN
135
FUER DEN GESUNDEN TRAEGER
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.2.1.8 GESUNDE TRAEGER BALANCIERTER TRANSLOKATIONEN UND 137
MARKERCHROMOSOMEN BEIM NACHKOMMEN
5.2.2 MARKERCHROMOSOMEN BEI NORMALER CHROMOSOMENANZAHL 137
5.2.2.1 GONOSOMALE MARKERCHROMOSOMEN 137
5.2.2.1.1 KASUISTIKEN 137
DERIVATE DES X-CHROMOSOMS 138
DERIVATE DES Y-CHROMOSOMS 140
5.2.2.1.2 DAS VORKOMMEN VON GONOSOMALEN MARKERCHROMOSOMEN IN ABHAENGIG-
142
KEIT VOM ALTER DER MUTTER UND DES VATERS
5.2.2.1.3 KARYOTYP-PHAENOTYP KORRELATION VON TRAEGEM MIT GONOSOMALEN 142
MARKERCHROMOSOMEN
DERIVATE DES X-CHROMOSOMS 143
DERIVATE DES Y-CHROMOSOMS 143
5.2.2.2 AUTOSOMALE MARKERCHROMOSOMEN 145
5.2.2.2.1 KASUISTIKEN 145
DERIVATE UNBALANCIERTER TRANSLOKATIONEN - 145
DERIVATE VON DUPLIKATIONEN-DELETIONEN-RINGCHROMOSOMEN 149
DERIVATE VERSCHIEDENER ABERRATIONSFORMEN 152
5.2.2.2.2 DAS VORKOMMEN AUTOSOMALER MARKERCHROMOSOMEN BEI NUMERISCH NOR-
154
MALEM CHROMOSOMENSATZ IN ABHAENGIGKEIT VOM ALTER DER MUTTER UND
DES VATERS
5.2.2.2.3 KARYOTYP-PHAENOTYP KORRELATION VON TRAEGEM MIT AUTOSOMALEN 155
MARKERCHROMOSOMEN BEI NORMALER CHROMOSOMENZAHL
6 DISKUSSION 156
TEIL 1: REVERSE FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG 156
6.1 METHODISCHE PRAEPARATION DER CHROMOSOMEN FUER DIE MIKROSEZIERUNG 156
FIXIERUNG' 156
UNGEFAERBTE GEGENUEBER GTG-GEBAENDERTEN CHROMOSOMEN 15 7
ALTER DER PRAEPARATE BEI DER ANALYSE 158
6.2 ANWENDUNG DER DOP-PCR ZUR AMPLIFIZIERUNG DER DNA 158
6.3 ANZAHL BENOETIGTER MARKERCHROMOSOMEN 159
6.4 AMPLIFIZIERUNG VON HETERO- BZW. EUCHROMATISCHEN REGIONEN 159
6.5 AUSBLICK: MOEGLICHE ANWENDUNGSGEBIETE DER MIKROSEZIERUNG UND DER 160
REVERSEN FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG
TEIL 2: DIE ANALYSE VON MARKERCHROMOSOMEN 161
6.6 STRATEGIEN ZUR ANALYSE VON MARKERCHROMOSOMEN 161
6.7 UEBERZAEHLIGE MARKERCHROMOSOMEN 163
6.8 GONOSOMALE MARKERCHROMOSOMEN BEI NUMERISCH NORMALEM 169
CHROMOSOMENSATZ
6.9 AUTOSOMALE MARKERCHROMOSOMEN BEI NUMERISCH NORMALEM 171
CHROMOSOMEN SATZ
7 ZUSAMMENFASSUNG 173
INHALTSVERZEICHNIS
V
8 LITERATURVERZEICHNIS 178
9 TABELLEN ANHANG 191
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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