Malattransport und partielle Reinigung des Malattransportproteins des Tonoplasten der CAM-Pflanze Kalanchoë daigremontiana:
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1993
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1. EINLEITUNG 1
1.1 DER CRASSULACEEN-SAEURESTOFFWECHSEL 1
1.2 DER TRANSPORT VON AEPFELSAEURE UND IHRES ANIONS MALAT UEBER DEN
TONOPLASTEN 2
1.3 SOLUBILISIERUNG UND REKONSTITUTION VON MEMBRANPROTEINEN 5
1.4 ZIEL DER ARBEIT 7
2. MATERIAL UND METHODEN 8
2.1 PFLANZENMATERIAL UND PFLANZENANZUCHT 8
2.2 ISOLIERUNG VON TONOPLASTENVESIKELN 9
2.2.1 PRAEPARATION UEBER PROTOPLASTEN 9
2.2.2 PRAEPARATION UEBER EIN MIXER-ROHHOMOGENAT 12
2.3 PROTEINBESTIMMUNG 13
2.4 BESTIMMUNG DER ATP-HYDROLYSE-AKTIVITAET 14
2.5 INDIREKTER NACHWEIS DER MALATAUFNAHME UEBER MESSUNGEN MIT
FLUORESZENZFARBSTOFFEN 16
2.5.1 PROTONENTRANSPORTMESSUNGEN MIT QUINACRIN 17
2.5.2 MEMBRANPOTENTIALMESSUNGEN MIT OXONOL VI 19
2.5.2.1 AUFNAHME VON ABSORPTIONSSPEKTREN 20
2.5.2.2 POTENTIALAUFBAU DURCH DEN ATP-ABHAENGIGEN PROTONENTRANSPORT 20
2.5.2.3 POTENTIALAUFBAU DURCH EINE ASYMMETRISCHE KALIUMVERTEILUNG 21
2.6 DIREKTER NACHWEIS DER MALATAUFNAHME UEBER MESSUNGEN MIT
J
4C-MALAT 23
2.6.1 ENERGETISIERUNG DES MALATTRANSPORTES UEBER DIE H
+-ATPASE 23
2.6.2 ENERGETISIERUNG UEBER EINE ASYMMETRISCHE KALIUMVERTEILUNG 25
2.7 SOLUBILISIERUNG DER TONOPLASTENPROTEINE 27
2.7.1 EINFACHE SOLUBILISIERUNG 27
2.7.2 SEQUENTIELLE SOLUBILISIERUNG 28
2.8 HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE 29
2.9 REKONSTITUTION MITTELS DETERGENZENTFERNUNG UEBER AMBERLITE XAD-2 30
2.9.1 REKONSTITUTION DER SOLUBILISIERTEN TONOPLASTENPROTEINE 31
2.9.2 REKONSTITUTION DES HYDROXYLAPATIT-ELUATES 31
2.10 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 32
2.10.1 PROBENVORBEREITUNG UND GELLAUF 35
2.10.2 SILBERFAERBUNG 36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.11 IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 37
2.11.1 WESTERN-BLOT UND IMMUNOGOLD-MARKIERUNG 37
2.11.2 SILBERVERSTAERKUNG VON IMMUNOGOLD-MARKIERUNGEN 40
2.12 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 41
2.12.1 GEFRIERBRUCH-TECHNIK 41
2.12.2 BILDAUSWERTUNG 42
2.13 STATISTIK 42
2.14 CHEMIKALIEN 43
3. ERGEBNISSE 45
3.1 CHARAKTERISIERUNG UND VERGLEICH DER TONOPLASTENVESIKEL-
PRAEPARATIONEN 45
3.1.1 PROTEINAUSBEUTE 45
3.1.2 REINHEITSKONTROLLE DER PRAEPARATE 46
3.1.3 PROTONENTRANSPORTAKTIVITAET 48
3.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR MALATAUFNAHME AN NATIVEN
TONOPLASTENVESIKELN 50
3.2.1 INDIREKTER NACHWEIS DER MALATAUFNAHME UEBER PROTONENTRANSPORT
MESSUNGEN 50
3.2.1.1 WIRKUNG VON MALAT AUF DEN ATP-ABHAENGIGEN PROTONENTRANSPORT 50
3.2.1.2 BESTIMMUNG DES K
M-WERTES FUER DIE MALATAUFNAHME 52
3.2.2 INDIREKTER NACHWEIS DER MALATAUFNAHME UEBER MEMBRANPOTENTIAL
MESSUNGEN 53
3.2.2.1 , WIRKUNG VON MALAT AUF DAS ATP-ABHAENGIGE MEMBRANPOTENTIAL 53
3.2.2.2 POTENTIALAUFBAU DURCH EINE ASYMMETRISCHE KALIUMVERTEILUNG 55
3.2.3 DIREKTER NACHWEIS DER MALATAUFNAHME UEBER MESSUNGEN MIT
14
C-MALAT 58
3.2.3.1 ENERGETISIERUNG DER MALATAUFNAHME UEBER DEN ATP-ABHAENGIGEN
PROTONENTRANSPORT 58
3.2.3.1.1 ABHAENGIGKEIT DER MALATAUFNAHME VON DER INKUBATIONSZEIT 58
3.2.3.1.2 ABHAENGIGKEIT DER MALATAUFNAHME VON DER MALATKONZENTRATION 60
3.2.3.2 ENERGETISIERUNG DER MALATAUFNAHME UEBER EINE ASYMMETRISCHE
KALIUMVERTEILUNG 61
3.2.3.2.1 ABHAENGIGKEIT DER MALATAUFNAHME VON DER KALIUMGLUCONAT-
KONZENTRATION 62
3.2.3.2.2 ABHAENGIGKEIT DER MALATAUFNAHME VON DER VORINKUBATIONS- UND
INKUBATIONSZEIT 63
3.2.3.2.3 HEMMUNG DES MALATTRANSPORTES 64
3.2.3.2.4 ABHAENGIGKEIT DER MALATAUFNAHME VON DER MALATKONZENTRATION 65
3.3 SOLUBILISIERUNG UND REKONSTITUTION DER TONOPLASTENPROTEINE 67
3.3.1 AUSWAHL EINES GEEIGNETEN DETERGENZ 67
3.3.2 NACHWEIS DER MALATTRANSPORTAKTIVITAET AN PROTEOLIPOSOMEN UEBER
PROTONENTRANSPORTMESSUNGEN 70
3.3.3 NACHWEIS DER MALATTRANSPORTAKTIVITAET AN PROTEOLIPOSOMEN UEBER
14
C-MALATAUFNAHMEMESSUNGEN 72
3.3.3.1 ENERGETISIERUNG DURCH DEN ATP-ABHAENGIGEN PROTONENTRANSPORT 72
3.3.3.2 ENERGETISIERUNG UEBER EINE ASYMMETRISCHE KALIUMVERTEILUNG 73
3.3.4 VERGLEICH DER PROTEINBANDEN MITTELS SDS-PAGE 73
3.4 PARTIELLE REINIGUNG DER TONOPLASTENPROTEINE UEBER HYDROXYLAPATIT-
CHROMATOGRAPHIE 75
3.4.1 PROTEINBILANZ DER REINIGUNG 76
3.4.2 REKONSTITUTION DER PARTIELL GEREINIGTEN PROTEINE UND NACHWEIS DER
MALATTRANSPORTAKTIVITAET 77
3.4.3 UNTERSUCHUNG DER PROTEINBANDEN MITTELS SDS-PAGE UND WESTERN-
BLOT 78
3.4.4 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 81
4. DISKUSSION 84
4.1 UNTERSUCHUNG DER KINETISCHEN PARAMETER DES MALATTRANSPORTERS AN
* NATIVEN TONOPLASTENVESIKELN AUS
KALANCHOE DAIGREMONTIANA 84
4.2 HEMMBARKEIT DES MALATTRANSPORTES 91
4.3 REKONSTITUTION DER TONOPLASTENPROTEINE 93
4.4 PARTIELLE REINIGUNG UND REKONSTITUTION DES MALATTRANSPORTERS 95
4.5 AUSBLICK 99
5. ZUSAMMENFASSUNG 100
6. LITERATUR
102 |
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