Kleine G-Proteine in Chlamydomonas Reinhardtii: Struktur und Expression von sechs ypt-Genen und Immuncytochemie der Genprodukte
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
IV
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
.
11
2.1.
ORGANISMEN,
BAKTERIOPHAGEN
UND
PLASMIDE
.
11
2.2.
HERKUNFT
VON
CHEMIKALIEN
UND
ENZYMEN
.
12
2.3.
VERWENDETE
OIIGONUKLEOTIDE
.
13
2.4.
NAEHRMEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
.
14
2.5.
PUFFER
.
15
3.
METHODEN
.
22
3.1.
KULTUREN
.
22
3.1.1.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
E.
COLI
.
22
3.1.2.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
C.
REINHARDTII
.
22
3.2.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
22
3.2.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
22
3.2.2.
ISOLIERUNG
VON
PBLUESCRIPT
II-PHAGEMID
DNA
AUS
XZAP
II-BAKTERIOPHAGEN
(IN
VIVO
EXCISION)
.
23
3.2.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
DEM
PHAGEN
XEMBL3
.
24
3.2.4.
ISOLIERUNG
VON
M13-PHAGEN
DNA
.
24
3.2.5.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
C.
REINHARDTII
.
24
3.2.6.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
C.
REINHARDTII
.
25
3.2.7.
GEWINNUNG
VON
C.
REINHANIRN-POLY(A)
+
-RNA
.
25
3.2.8.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
DURCH
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
25
3.2.9.
AUFTRENNUNG
VON
RNA
DURCH
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
26
3.2.10.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
UND
REINIGUNG
VON
PCR
PRODUKTEN
MITTELS
GENE-CLEAN
(GENE-CLEANLL-KIT
VON
BIO
101).26
3.2.11.
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
26
3.2.12.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
27
3.3.
ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
.
27
3.3.1.
SPALTEN
VON
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENZYME
.
27
3.3.2.
BEHANDLUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
DER
BAKTERIOPHAGE
T4
DNA-POLYMERASE
.
27
3.3.3.
BEHANDLUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
DER
KLENOW-POLYMERASE
.
27
3.3.4.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
28
3.3.5.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
28
3.3.6.
LIGIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
VEKTOR-DNA
.
28
3.3.7.
ERSTSTRANG-CDNA-SNTHESE
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTION
VON
RNA
.
.28
3.3.8.
PCR-AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
.
29
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.4.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
.
30
3.4.1.
KLONIERUNG
DURCH
DISEC/TRISEC
.
30
3.4.2.
KLONIERUNG
UBER
"GLATTE"
DNA-ENDEN
.
31
3.4.3.
KLONIERUNG
UBER
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
.
31
3.5.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
DURCH
PLASMID-DNA
.
31
3.6.
DNA-SEQUENZANALYSE
.
32
3.6.1.
SEQUENZIER-REAKTION
.
32
3.6.2.
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
.
32
3.7.
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
VON
NUKLEINSAEURE
.
32
3.7.1.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
UND
RNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLON-FILTER
(SOUTHERN
BLOT,
NORTHERN
BLOT)
.
32
3.7.2.
TRANSFER
VON
PHAGEN-DNA
AUF
MEMBRANEN
(PLAQUE
LIFTING)
.
33
3.7.3.
TRANSFER
VON
DNA
AUS
BAKTERIENKOLONIEN
(KOLONIEHYBRIDISIERUNG)
.
.33
3.7.4.
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
.
33
3.7.5.
PRAEHYBRIDISIERUNG
UND
HYBRIDISIERUNG
.
34
3.7.6.
DETEKTION
DER
HYBRIDISIERENDEN
NUKLEINSAEURE
.
DURCH
CHEMILUMINESZENZ
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
34
3.8.
HETEROLOGE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
C.
REINHARDTII
YPT-PROTEINE
IN
E.
COLI
.
34
3.8.1.
DAS
PET-19B
/
E.
COZIBL21(DE3)-EXPRESSIONSSYSTEM
.
34
3.8.2.
ANZUCHT
DER
ZELLEN
UND
INDUKTION
DER
YPT-EXPRESSION
.
35
3.9.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
35
3.9.1.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
C.
REINHARDTII
YPT-PROTEINE.
.
35
3.9.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
36
3.9.3.
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
.
37
3.9.4.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
37
3.9.5.
ANFAERBEN
VON
SDS-GELEN
DURCH
COOMASSIE-BLAU
.
37
3.9.6.
TRANSFER
AUFGETRENNTER
PROTEINE
AUF
NITROCELLULOSE-FILTER
(WESTERN
BLOT)
.
.
;
.
37
3.9.7.
IMMUNCHEMISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
CHEMILUMINESZENZ.
.
37
3.9.8.
NACHWEIS
DER
SPEZIFISCHEN
GTP-BINDUENG
DURCH
YPT-PROTEINE
(GTP-BINDE-TEST)
.
38
3.10.
PRODUKTION
VON
AYPTC6-ANTIKOERPER
.
38
3.10.1.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
.
38
3.10.2.
GEWINNUNG
DES
AYPTC6-SERUMS
.
39
3.10.3.
REINIGUNG
DES
ROHSERUMS
.
39
3.10.3.1.
REINIGUNG
DURCH
PROTEIN
A-SAEULEN-CHROMATOGRAPHIE
.
39
3.10.3.2.
REINIGUNG
VON
KREUZREAGIERENDEN
ANTIKOERPERN
(AFFINITAETSREINIGUNG):
.
39
3.11.
IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE
.
40
INHALTSVERZEICHNIS
VI
4.
ERGEBNISSE
.
41
4.1.
DISEC/TRISEC,
EIN
NEUES
VERFAHREN
ZUR
KLONIERUNG
PCR
AMPLIFIZIERTER
DNA-FRAGMENTE
.
41
4.2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
C.
REINHARDTII
YPT-GENEN
.
46
4.2.1.
ISOLIERUNG
VON
YPT-GENEN
AUS
EINER
GENOMISCHEN
X.EMBL3-GENBANK.
46
4.2.2.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
UND
SEQUENZIERUNGS-STRATEGIE
FUER
YPTCL,
YPTC4,
YPTC5UNAEYPTC6
.
47
4.2.3.
NUKLEOTIDSEQUENZ
UND
GENORGANISATION
.
50
4.2.4.
KOPIENZAHL
VON
YPT-GENEN
.
56
4.2.5.
ISOLIERUNG
VON
YPT-CDNAS
.
58
4.2.5.1.
ISOLIERUNG
DER
YPTCL-,
YPTC4-,
YPTCS
U.
YPTCOE-CDNA
AUS
RNA
MITTELS
PCR
.
58
4.2.S.2.
ISOLIERUNG
UND
SUBKLONIERUNG
DER
YPTCL
UND
YPTC5
CDNA
AUS
EINER
X.ZAP
II
CDNA-BANK
.
60
4.2.6.
CODON
AUSWAHL
.
62
4.3.
ABGELEITETE
PRIMAERSTRUKTUREN
UND
AMINOSAEURESEQUENZ-VERGLEICH
62
4.4.
EXPERIMENTE
ZUR
ISOLIERUNG
DER
KOMPLETTEN
YPT-GENFAMILIEN
AUS
C.
REINHARDTII
UND
V.
CARTERI
.
66
4.4.1.
AMPLIFIKATION
VON
YPT-DNA
FRAGMENTEN
AUS
GENOMISCHER
DNA
.
66
4.4.2.
AMPLIFIKATION
UND
KLONIERUNG
VON
YPT-DNA-FRAGMENTEN
AUS
ERSTSTRANG-CDNA
.
70
4.5.
BIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
73
4.5.1.
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
C.
REINHARDTII
YPT-GENEN
IN
E.
COLI
.
73
4.5.1.1.
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
.
73
4.5.1.2.
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
C.
REINHARDTII
-
YPT-PROTEINE
IN
E.
COLI
BL21(DE3)-ZELLEN
.
76
4.5.2.
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
C.
REINHARDTII
YPT-PROTEINE
DURCH
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
("IMAC")
.
77
4.5.3.
NACHWEIS
EINER
SPEZIFISCHEN
GTP-BINDUNG
.
78
4.6.
IMMUNCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
80
4.6.1.
SPEZIFITAETS-NACHWEIS
DER
AYPT-ANTISEREN
.
80
4.6.2.
SEROLOGISCHE
BESTIMMUNGEN
DER
YPT-GENEXPRESSION
IN
C.
REINHARDTII
UND
V.
CARTERI
.
82
4.6.3.
IMMUNCYTOLOGISCHE
LOKALISATION
DER
YPT-PROTEINE
DURCH
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSE
.
83
INHALTSVERZEICHNIS
VII
5.
DISKUSSION
.
91
5.1.
GENE
UND
GENORGANISATION
.
91
5.1.1.
5'
UTRS
UND
3'
UTRS
.
91
5.1.2.
INTRONS
.
95
5.1.3.
CODON-AUSWAHL
.
97
5.2.
ABGELEITETE
PRIMTTRSTRUKTUREN
DER
YPT-PROTEINE
.
99
5.3.
LOKALISIERUNG
DER
YPT-PROTEINE
IN
C.
REINHARDTII-ZELLEN
.
105
5.4.
AUSBLICK
.
108
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
109
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
112 |
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