Einfluß Phospholipid-spezifischer und allgemeiner Transkriptionsfaktoren auf die Expression der Fettsäure Synthase Gene FAS1 und FAS2 der Hefe S. cerevisiae:
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| Published: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
.
ZUSAMMENFASSUNG
1
I.
EINLEITUNG
2
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
13
1.
GERAETE
13
2.
CHEMIKALIEN
UND
LABORHILFSMITTEL
14
3.
ENZYME
14
4.
VERWENDETE
ORGANISMEN
15
4.1
ECO/ASTAEMME
15
4.2
HEFESTAEMME
15
5.
NAEHRMEDIEN
16
5.1
BAKTERIENMEDIEN
16
5.2
HEFEMEDIEN
16
6.
PLASMIDE
UND VEKTOREN
17
7.
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
17
8.
ANZUCHT
VON
E.COLI
UND
HEFEZELLEN
18
9.
ZELLDICHTEBESTIMMUNGEN
18
10.
ZELLROHEXTRAKTE
AUS
HEFE
18
11.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
VON
PROTEINLOESUNGEN
19
11.1
MIKROBIURET-METHODE
19
11.2
BRADFORD-METHODE
19
12.
ENZYMAKTIVITAETS-BESTIMMUNGEN
20
12.1
8-GALAKTOSIDASE-ENZYMTEST
20
12.2
FAS-AKTIVITAETSTEST
21
13.
DNA-ISOLIERUNGEN
21
13.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
21
13.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
DEM
"QIAGEN-KIT
"
21
13.1.2
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIMBOIM/DOLV
23
13.1.3
ANALYTISCHE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
NACH
BIRNBOIM/DOLY
13.1.4
"MINISCREEN"-METHODE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
13.2
ISOLIERUNG
VON
M13-PHAGEN-DNA
13.2.1
ISOLIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
13.2.2
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
14.
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
15.
ELEKTROPHORETISCHE
TECHNIKEN
15.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
FUER
DNA-FRAGMENTE
15.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
15.2.1
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
FUER
DNA-FRAGMENTE
15.2.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
DNA-SEQUENZIERUNG
15.2.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
FUER
RETARDIERUNGSANALYSEN
16.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
16.1
ISOLIERUNG
NACH
DER
"FREEZE-SQUEEZE"-METHODE
16.2
ISOLIERUNG
MIT
DEM
"
QIAEX
"
-GELEXTRAKTIONSKIT
17.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
18.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNA
18.1
RESTRIKTIONSENDONUKLEOLYTISCHE-SPALTUNG
VON
DNA
18.2
VERKUERZUNG
LINEARER
DNA-MOLEKUELE
MIT
BAL31-EXONUKLEASE
18.3
LINKER-INSERTION
18.4
LIGATION
VON
DNA
19.
TRANSFORMATIONSTECHNIKEN
19.1
TRANSFORMATION
IN
E.COLL
19.1.1
HERSTELLUNG
UND
LAGERUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
ZELLEN
19.1.2
TRANSFORMATION
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
19.1.3
TRANSFEKTION
MIT
PHAGEN-DNA
19.2
HEFETRANSFORMATION
20.
DNA-SEQUENZIERUNG
20.1
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDESOXY-TERMINATIONSMETHODE
20.1.1
DENATURIERUNG
DES
DOPPELSTRANGES
20.1.2
SEQUENZIERREAKTIONEN
20.2
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
METHODE
VON
MAXAM
UND
GILBERT
21.
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
21.1
OLIGONUKLEOTID-PHOSPHORYLIERUNG
UND
MUTAGENESE
41
21.2
TRANSFEKTION
IN
E.COLI
(DUT
'
,
UNG
'
)
42
22.
HERSTELLUNG
EINES
PROTEINBINDUNGSEXTRAKTES
AUS
HEFE
43
22.1
HERSTELLUNG
VON
GESAMTPROTEIN-EXTRAKTEN
43
22.2
HERSTELLUNG
AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERTER
PROTEINEXTRAKTE
43
23.
ANREICHERUNG
DNA-BINDENDER
PROTEINE
DURCH
AFFINITAETSCHROMATO
44
GRAPHIE
AN
HEPARIN-SEPHAROSE
24.
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTE
45
24.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
EINES
DNA-FRAGMENTS
45
24.2
PROTEIN-DNA-BINDUNGSREAKTION
46
25.
IN
VITRO
DNASE-PROTEKTIONSANALYSE
("FOOTPRINT")
46
25.1
MARKIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
FUER
DIE
"FOOTPRINT"
47
ANALYSE
25.1.1
FRAGMENTISOLIERUNG
47
25.1.2
FRAGMENTMARKIERUNG
47
25.1.3
FRAGMENTREINIGUNG
48
25.2
"FOOTPRINT"-REAKTION
48
25.2.1
PROTEIN-DNA-BINDUNGREAKTION
48
25.2.2
DNASE-BEHANDLUNG
UND
ELEKTROPHORESE
49
IV.
ERGEBNISSE
50
1.
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
UAS
FM
-ELEMENTE
IN
DEN
50
PROMOTOREN
DER
FAS-GENE
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISLAE
1.1
GERICHTETE
MUTAGENESE
DER
FBF1-BINDESTELLEN
IM
FAS1
-PROMOTOR
51
1.1.1
INSERTION
DER
5'-FIANKIERENDEN
FASI-REGION
(POSITION
-1497
BIS
-427)
52
IN
DEN
PHAGEN
M13MP18
1.1.2
OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE
MUTAGENESE
DER
EINZELNEN
UAS
FAS1
-MOTIVE
52
1.1.3
OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE
MUTAGENESE
BEIDER
UAS
FAS1
-ELEMENTE
57
1.1.4
INSERTION
DER
MUTAGENISIERTEN
FASI-PROMOTORBEREICHE
IN
EIN
57
HETEROLOGES
TESTSYSTEM
1.2
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
FBF1-BINDESTELLE
IM
FAS2-PROMOTOR
62
1.3
BESTAETIGUNG
DER
BEDEUTUNG
DES
/NO4-GENPRODUKTS
FUER
DAS
UAS
FM
-
64
VERMITTELTE
AKTIVIERUNGSPOTENTIAL
2.
GELRETARDIERUNGEXPERIMENTE
MIT
DEN
FRAGMENTEN
F1
UND
F2
AUS
DER
65
FAS
7
-PROMOTORREGION
(POSITION
-918
BIS
-689)
3.
UNTERSUCHUNG
DER
FBF1
-UNABHAENGIGEN
AKTIVATOR-ELEMENTE
IM
FAS1-
74
PROMOTOR
DURCH
LINKERDELETIONSANALYSE
3.1
EXONUKLEOLYTISCHE
VERKUERZUNG
DES
FASF-PROMOTORS,
AUSGEHEND
74
VON
DER
XHOL-SCHNITTSTELLE
AN
POSITION
-619
3.2
BAL31
-ABBAU
DES
FASF-PROMOTORS
VON
DER
BGLLL-SCHNLTTSTELLE
AN
78
POSITION
-1232
AUSGEHEND
4.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
DER
ABF1
-BINDESTELLE
FUER
DIE
REGULATION
DER
86
FASJ-GENEXPRESSION
5.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
EINER
POTENTIELLEN
RAP1-BINDESTELLE
FUER
DIE
88
FASF-GENEXPRESSION
5.1
PROTEIN-DNA-INTERAKTIONEN
DES
POTENTIELLEN
RAP1-BINDEMOTIVS
IM
89
FASF-PROMOTOR
5.1.1
GELRETARDIERUNGSANALYSE
DER
POTENTIELLEN
RAP1-BINDESTELLE
89
5.1.2
INTERAKTION
ZWISCHEN
DEM
RAPF-GENPRODUKT
UND
DEM
FASF-PROMOTOR
91
5.1.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IDENTITAET
VON
RAP1
MIT
DEM
BINDEFAKTOR
FBF2
94
5.1.4
"FOOTPRINF-ANALYSE
DER
RAP1
-BINDESTELLE
96
5.1.4.1
ISOLIERUNG
UND
MARKIERUNG
GEEIGNETER
FASF-FRAGMENTE
96
5.1.4.2
HERSTELLUNG
EINES
GEEIGNETEN
PROTEINEXTRAKTES
98
5.1.4.3
PROTEIN/DNA-BINDUNGSBEDINGUNGEN
99
5.1.4.3
IN
VITRO
"FOOTPRINF-ANALYSE
100
5.2
FUNKTIONELLE
IN
VIVO
CHARAKTERISIERUNG
DER
RAP1-BINDESTELLE
DES
102
FASJ-PROMOTORS
5.2.1
INSERTION
DES
DNA-FRAGMENTS
OF1
IN
DAS
PROMOTORTESTSYSTEM
PJS205
102
5.2.2
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
RAP1-BINDESTELLE
IM
FAS1
-PROMOTOR
104
5.3
UNTERSUCHUNG
DER/N
VFTRO
FUNKTIONALITAET
DER
MUTAGENISIERTEN
RAP1
107
BINDESTELLE
6.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
EINER
POTENTIELLEN
GCR1-BINDESTELLE
FUER
DIE
109
FASJ-GENEXPRESSION
6.1
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEIN-DNA-INTERAKTIONEN
DES
POTENTIELLEN
GCR1
111
MOTIVS
IM
FASI-PROMOTOR
6.2
FUNKTIONELLE
IN
VIVO
CHARAKTERISIERUNG
DER
MOEGLICHEN
GCR1-BINDESTEUE
113
DES
FASI-PROMOTORS
6.2.1
INSERTION
DES
DNA-FRAGMENTS
OF2
IN
PJS2O5
113
6.2.2
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
GCR1-BINDESTELLE
IM
FASI-PROMOTOR
114
6.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
FAS1
UND
FAS2-PROMOTORAKTIVITAETEN
IN
EINER
115
GCR1
-HEFE-NULLMUTANTE
IM
VERGLEICH
ZUM
ISOGENEN
WILDTYP
6.3.1
EXPRESSIONSSTUDIEN
IM
HETEROLOGEN
TESTSYSTEM
116
6.3.2
VERGLEICH
DER
SPEZIFISCHEN
FETTSAEURE
SYNTHASE-AKTIVITAET
IN
EINER
AGCRF
117
MUTANTE
IM
VERGLEICH
ZUM
ISOGENEN
WILDTYP
7.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
POTENTIELLER
REB1-BINDESTELLEN
FUER
DIE
FAS
117
GENEXPRESSION
7.1
PROTEIN-DNA-INTERAKTIONEN
DER
BEIDEN
POTENTIELLEN
REB1-BINDESTELLEN
118
DES
FAS1-PROMOTORS
7.1.1
GELRETARDIERUNGSANALYSE
DER
BEIDEN
POTENTIELLEN
REB1-BINDESTELLEN
118
7.1.2
NACHWEIS
DER
IDENTITAET
VON
FBF3
MIT
REB1
122
7.1.3
"FOOTPRINT
'
-ANALYSE
DER
FASI-PROMOTORREGION
VON
POSITION
-918
BIS
-689
124
7.1.3.1
ISOLIERUNG
UND
MARKIERUNG
GEEIGNETER
FASI-PROMOTORFRAGMENTE
124
7.1.3.2
IN
VITRO
"
FOOTPRINT'-ANALYSE
125
7.2
IN
VITRO
CHARAKTERISIERUNG
DER
POTENTIELLEN
REB1-BINDESTELLE
IN
DER
130
FAS2-PROMOTORREGION
7.3
FUNKTIONELLE
IN
VIVO
CHARAKTERISIERUNG
DER
REB1-BINDSESTELLE
IM
134
FASI-PROMOTOR
7.3.1
INSERTION
DER
DNA-FRAGMENTE
OF3
UND
OF5
IN
EIN
HETEROLOGES
134
TESTSYSTEM
7.3.2
GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
DER
REB1
-BINDESTELLE
IM
FASI-PROMOTOR
135
7.3.3
EINFLUSS
VON
RAP1
,
REB1
UND
ABF1
AUF
DAS
AKTIVIERUNGSPOTENTIAL
DER
139
FASI-PROMOTORREGION
VON
POSITION
-863
BIS
-619
8.
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
DES
GCA-SEQUENZMOTIVS
FUER
DIE
FAS
142
GENEXPRESSION
V.
DISKUSSION
146
VI.
ANHANG
162
ABKUERZUNGEN
162
LITERATURVERZEICHNIS
164
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
1
UEBERBLICK
UEBER
DIE
ZU
BEGINN
DIESER
ARBEIT
BEKANNTEN
REGULATORISCHEN
7
ELEMENTE
IN
DEN
BEIDEN
FAS-PROMOTOREN.
2
RESTRIKTIONSKARTE
DES
PLASMIDS
PJS200X.
53
3
PLASMIDKARTEN
DER
HEFE/E.CO//-"SHUTTLE"-VEKTOREN
PJS205
UND
58
PJS205BXX.
4
RESTRIKTIONSKARTEN
DER
PLASMIDE
PJS232N
UND
PSA3.
60
5
LAGE
DER
IN
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTEN
EINGESETZTEN
DNA
70
FRAGMENTE
AUS
DER
5
'
-FLANKIERENDEN
FASI-REGION.
6
RESTRIKTIONSKARTE
VON
PJS252.
71
7
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTE
MIT
DEN
DNA-FRAGMENTEN
F1
(A)
BZW.
72
F2
(B).
8
RESTRIKTIONSANALYSE
VON
BAL31-DELETIONSKONSTRUKTEN.
76
9
RESTRIKTIONSANALYSE
VON
BAL31-DELETIONSKONSTRUKTEN.
79
10
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
DER
AKTIVITAETSTESTS,
DIE
NACH
81
TRANSFORMATION
DER
VERKUERZTEN
REPORTERGENKONSTRUKTE
AUS
DEN
BEIDEN
GEGENLAEUFIGEN
DELETIONSANALYSEN
IN
HEFE
GEMESSEN
WURDEN.
11
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT
MIT
DEM
DNA-FRAGMENT
OF1
ALS
90
RADIOAKTIVE
PROBE.
12
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT
MIT DEM
DNA-FRAGMENT
RAP12
ALS
92
RADIOAKTIVE
PROBE.
13
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT
MIT
DEM
DNA-FRAGMENT
OF1
ALS
93
RADIOAKTIVE
PROBE.
14
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENT
MIT
DEM
FRAGMENT
F1
ALS
DNA-PROBE.
95
15
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PSA79,
DESSEN
INSERT
ZUR
"FOOTPRINT
"
-
97
ANALYSE
DER
RAP1-BINDESTELLE
BENUTZT
WURDE. |
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