Zur Sink-Regulation der Photosynthese: Kohlenhydrate und Genexpression
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
VII
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
8
2.1
CHEMIKALIEN
8
2.2
PFLANZENANZUCHT
8
2.2.1
SPINACIA
OLERACEA
8
2.2.2
NICOTIANA
TABACUM
9
2.2.3
SOLANUM
TUBEROSUM
10
2.2.4
CHENOPODIUM
RUBRUM
10
2.3
VERSUCHSSYSTEME
12
2.3.1
GLUKOSE-APPLIKATION
AN
INTAKTE
BLAETTER
12
2.3.2
BLATTSTIEIKUEHLUNG
12
2.3.3
[35S]METHIONIN
PULS
BEI
CHENOPODIUM
RUBRUM
ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
13
2.4
PROBENNAHME
13
2.4.1
CHENOPODIUM
RUBRUM
13
2.4.2
BLAETTER
13
2.4.3
TABAKPFLAENZCHEN
13
2.5
GASAUSTAUSCH
VON
KOHLENDIOXID
UND
WASSERDAMPF
13
2.5.1
MESSSYSTEM
13
2.5.2
GASWECHSELBERECHNUNGEN
14
2.6
BESTIMMUNG
VON
CHLOROPHYLL-,
PHAEOPHYTIN
UND
PROTEINMENGEN
15
2.6.1
CHLOROPHYLL-BESTIMMUNG
15
2.6.2
PHAEOPHYTIN-BESTIMMUNG
15
2.6.3
PROTEIN-BESTIMMUNG
16
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.7
BESTIMMUNG
DER
METABOLITSPIEGEL
UND
DES
FRUKTOSE
2,6
BISPHOSPHAT-GEHALTES
16
2.7.1
HERSTELLUNG
VON
EXTRAKTEN
17
2.7.1.1
CHLOROFORM-METHANOL-EXTRAKTION
17
2.7.1.2
PERCHLORSAEURE-EXTRAKTION
17
2.7.2
METABOLITBESTIMMUNGEN
18
2.7.2.1
HEXOSEPHOSPHATE
UND
UDP-GLUKOSE
18
2.7.2.2
TRIOSEPHOSPHATE
UND
FRUKTOSE-1,6-BISPHOSPHAT
19
2.7.2.3
3-PHOSPHOGLYZERINSAEURE
20
2.7.3.4
RIBULOSE-L,5-BISPHOSPHAT
20
2.7.2.5
FRUKTOSE
2,6-BISPHOSPHAT
22
2.8
ETHANOLISCHE
EXTRAKTION
UND
STAERKEBESTIMMUNG
23
2.8.1
EXTRAKTION
23
2.8.2
BESTIMMUNG
VON
GLUKOSE,
FRUKTOSE
UND
SACCHAROSE
24
2.8.3
STAERKEBESTIMMUNG
24
2.9
BESTIMMUNG
VON
AMINOSAEUREGEHALTEN
25
2.9.1
EXTRAKTION
25
2.9.2
AUFTRENNUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
MITTELS
HPLC
25
2.10
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
26
2.10.1
EXTRAKTION
26
2.10.2
BESTIMMUNG
VON
EXTRAHIERBAREN
ENZYMAKTIVITAETEN
26
2.10.2.1
PHOSPHOFRUKTOKINASE
(PFK)
27
2.10.2.2
PYROPHOSPHATABHAENGIGE
PFK
(PFP)
28
2.10.2.3
PYRUVATKINASE
(PK)
28
2.10.2.4
STROMALE
FRUKTOSEL,6BISPHOSPHATASE
(FBPASE)
29
2.10.2.5
NADP-ABHAENGIGE
GLYZERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE
(GAPDH)
29
2.10.2.6
RIBULOSE-L,5-BISPHOSPHAT-CARBOXYLASE-OXYGENASE
(RUBISCO)
30
2.10.2.7
SACCHAROSEPHOSPHATSYNTHASE
(SPS)
31
2.11
BESTIMMUNG
DER
RUBISCO-PROTEINMENGE
MITTELS
ELISA
32
2.12
ISOENZYMANALYSE
33
2.12.1
STAERKE-GELELEKTROPHORESE
34
2.12.1.1
GELSYSTEM
34
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.12.1.2
AKTIVITAETSFAERBUNG
35
2.12.2
ZYMOGRAMM
FUER
STAERKEPHOSPHORYLASE
36
2.12.3
ISOLIERUNG
VON
CHLOROPLASTEN
36
2.13
GELELEKTROPHORESEN
ZUR
PROTEINTRENNUNG
37
2.13.1
DENATURIERENDES
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
37
2.13.2
NATIVES
POLYACRYLAMIDGEL
37
2.13.3
ZWEI-DIMENSIONALES
POLYACRYLAMIDGEL
38
2.13.4
GEL-FAERBUNG
38
2.13.5
ELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
3
8
2.13.6
FLUOROGRAPHIE
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
38
2.14
IMMUNOPRAEZIPITATION
39
2.15
NORTHERN
BLOT-ANALYSE
40
2.15.1
RNA-EXTRAKTION
40
2.15.2
PRAEPARATION
VON
RADIOAKTIVEN
SONDEN
40
2.15.2.1
VERWENDETE
PLASMIDE
40
2.15.2.2
PLASMIDISOLIERUNG
41
2.15.2.3
PRAEPARATION
VON
INSERTS
42
2.15.2.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
INSERTS
42
2.15.3
NORTHERN
BLOT
43
2.15.4
HYBRIDISIERUNG
UND
AUTORADIOGRAPHIE
43
2.16
RUN-ON
TRANSKRIPTIONS-EXPERIMENT
44
2.16.1
PRAEPARATION
VON
ZELLKERNEN
AUS
CHENOPODIUM
RUBRUM
ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
44
2.16.2
RUN-ON
TRANSKRIPTIONS-INKUBATION
UND
QUANTIFIZIERUNG
44
2.17
DNA-BINDENDE
PROTEINE
45
2.17.1
PRAEPARATION
VON
KEMPROTEINEN
45
2.17.1.1
ISOLIERUNG
VON
ZELLKERNEN
45
2.17.1.2
ISOLIERUNG
VON
KEMPROTEINEN
46
2.17.2
ENDMARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
46
2.17.3
INKUBATION
ZUR
KOMPLEXBILDUNG
46
2.17.4
NATIVES
POLYACRYLAMIDGEL
47
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.
ERGEBNISSE
48
3.1
CHENOPODIUM
RUARUM-ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
ALS
MODELLSYSTEM
FUER
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
48
3.1.1
EFFEKT
VON
50
MM
GLUKOSE
IM
MEDIUM
48
3.1.1.1
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
49
3.1.1.2
ENZYMAKTIVITAETEN
49
3.1.1.3
RICS-TRANSKRIPT-MENGE
50
3.1.1.4
PHOTOSYNTHESERATE
51
3.1.2
UEBERPRUEFENDESSYSTEMS
51
3.1.2.1
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
51
3.1.2.2
OSMOTISCHE
EFFEKTE
52
3.1.3
ZEITKINETIK
53
3.1.3.1
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
53
3.1.3.2
TRANSKRIPTMENGEN
54
3.1.3.3
ENZYMAKTIVITAETEN
56
3.1.3.4
METABOLITSPIEGEL
56
3.2
BEDEUTUNG DER
GENREGULATION
DURCH
KOHLENHYDRATANHAEUFUNG
IN
BLAETTERN
58
3.2.1
GLUKOSEFUTTERUNG
AN
ABGESCHNITTENE
SPINATBLAETTER
58
3.2.1.1
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
58
3.2.1.2
ENZYMAKTIVITAETEN
59
3.2.1.3
RAECS-TRANSKRIPT-MENGE
60
3.2.2
TRANSGENE
TABAKPFLANZEN
MIT
INVERTASE-AKTIVITAET
IN
DER
ZELLWAND
62
3.2.2.1
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
64
3.2.2.2
MENGE
AN
RDCS-TRANSKRIPT
64
3.2.3
INDUZIERTER
ANSTAU
VON
KOHLENHYDRATEN
IN
BLAETTERN
DURCH
KUEHLEN
DES
PETIOLS
65
3.2.3.1
GEHALTE
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN,
STAERKE
UND
METABOLITEN
66
3.2.3.2
RAECS-TRANSKRIPT-MENGEN
UND
RUBISCO-AKTIVITAET
68
3.3
DIE
BEDEUTUNG
DER
INHIBITION
DER
GENEXPRESSION
PHOTOSYNTHETISCHER
PROTEINE
NACH
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
BEI
DER
SINK-REGULATION
DER
PHOTOSYNTHESE
70
3.3.1
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
70
3.3.2
GASWECHSELDATEN
72
3.3.3
METABOLITSPIEGEL
74
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.3.4
SPS-AKTIVIERUNG
76
3.3.5
FRU2,6BISP-SPIEGEL
77
3.3.6
AKTIVIERUNG
VON
RUBISCO
UND
RUBISCO-AKTIVITAET
77
3.3.7
TRANSKRIPTMENGEN
78
3.4
&'NK-REGULATION
DER
PHOTOSYNTHESE
UNTER
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
82
3.4.1
WACHSTUMSDATEN
83
3.4.2
GEHALT
AN
LOESLICHEN
ZUCKERN
UND
STAERKE
84
3.4.3
CHLOROPHYLLGEHALT
86
3.4.4
RUBISCO-EXPRESSION
86
3.5
EINFLUSS
DER
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
PLASTIDAEREN
UND
ZYTOSOIISCHEN
ISOENZYMPAAREN
90
3.5.1
FRAGESTELLUNG
90
3.5.2
ERGEBNISSE
91
3.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
WIRKMECHANISMUS
VON
KOHLENHYDRATEN
AUF
DIE
GENEXPRESSION
95
3.6.1
ABNAHME
DER
MENGE
AN
RUBISCO-PROTEIN
95
3.6.1.1
SYNTHESERATE
VON
RUBISCO
95
3.6.1.2
TRANSKRIPTIONSRATE
DES
RHCS-GENS
98
3.6.1.3
DNA-BINDENDE
PROTEINE
99
3.6.2
SIGNAL
UND
SIGNALTRANSDUKTIONSWEG
102
3.6.2.1
GLUKOSE-ANALOGA
103
3.6.2.2
PHOSPHATSEQUESTRIERENDE
AGENZIEN
UND
PHOSPHAT
104
3.6.2.3
VERAENDERN
DES
C/N-VERHAELTNISSES
108
3.6.2.4
VERAENDERN
DES
CO2-ANGEBOTS
112
3.6.2.5
FRU2,6BISP-SPIEGEL-VERAENDEMDE
STOFFE
113
3.6.2.6
PFP-ONTAENRE-PFLANZEN
114
3.6.2.7
PYROPHOSPHORYLASE-EXPRIMIERENDE
PFLANZEN
115
3.6.2.8
TRIOSEPHOSPHAT-TRANSLOKATOR-ANRISENSE-PFLANZEN
117
4.
DISKUSSION
119
4.1
CHENOPODIUM
RUOERWN-ZELLSUSPENSIONSKULTUREN
ALS
MODELLSYSTEM
FUER
119
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
INHALTSVERZEICHNIS
VI
4.2
BEDEUTUNG
DER
GENREGULATION
DURCH
KOHLENHYDRAT-ANHAEUFUNG
IN
BLAETTERN
122
4.3
DIE
BEDEUTUNG
DER
INHIBITION
DER
GENEXPRESSION
PHOTOSYNTHETISCHER
PROTEINE
NACH
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
BEI
DER
JZN^-REGULATION
DER
PHOTOSYNTHESE
124
4.4
AEN-REGULATION
DER
PHOTOSYNTHESE
UNTER
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
128
4.5
EINFLUSS
DER
KOHLENHYDRAT-AKKUMULATION
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
PLASTIDAEREN
UND
ZYTOSOLISCHEN
ISOENZYMEN
129
4.6
MECHANISMUS
DER
WIRKUNG
VON
KOHLENHYDRATEN
AUF
DIE
GENEXPRESSION
130
4.6.1
AENDERUNG
DER
RUBISCO-PROTEINMENGE
130
4.6.2
SIGNAL
UND
SIGNALTRANSDUKTION
134
4.7
REGULATION
DES
STOFFWECHSELS
DURCH
GLUKOSE
BEI
HEFE
137
4.8
METABOLITREGULATION
BEI
ANDEREN
GENEN
138
4.9
AUSBLICK
140
5.
ZUSAMMENFASSUNG
141
6.
SUMMARY
144
7.
LITERATURVERZEICHNIS
146 |
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| author | Krapp, Annemarie |
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