Untersuchung der Struktur-Funktions-Prinzipien im p36-p11-Komplex durch biophysikalische Methoden:
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| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
1993
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | V, 152 S. Ill., graph. Darst. |
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-I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VI
I.
EINLEITUNG
1
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
8
1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
8
1.0.
ORGANISMEN
8
1.0.1.
ZELLANZUCHT
8
L.O.L.L.
NAEHRMEDIEN
8
1.0.1.2,
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
9
1.1.
DNS-STANDARDTECHNIKEN
9
1.1.1.
AGAROSE-GELELKTROPHORESE
9
1.1.2.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNS
10
1.1.3.
EXTRAKTION
VON
DNS
10
1.1.4.
PRAEZIPITATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
11
1.1.5.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNS
11
1.1.7.
PLASMIDVEKTOREN
12
1.1.8.
VORBEREITUNG
DES
PLASMIDVEKTORS
FUER
DIE
LIGATION
12
1.1.9.
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENT
UND
PLASMIDVEKTOR
13
1.1.9.1,
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
KURZEN
EINZEL
STRAENGIGENUEBERHAENGEN
(STICKY
END)
14
I.1.9.2.
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
STUMPFEN
ENDE
15
1.1.10.
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
16
1.1.11.
PLASMIDE
17
1.1.11.1.
ANALYTISCHE
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
(MINIPRAEPARATION)
17
1.1.11.2.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
(MAXIPRAEPARATION)
18
1.1.12.
OLIGONUKLEOTIDE
18
1.1.12.1.
SYNTHESE
18
1.1.12.2.
AUFREINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
18
1.1.13.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
AM
5
'
-ENDE
19
1.1.14.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
CDNS-FRAGMENTEN
20
1.1.14.1.
NICK-TRANSLATION
20
1.1.14.2.
DNS-MARKIERUNGS-REAKTION
(RANDOM
PRIME-METHODE
22
1.1.15.
ARBEITEN
MIT
X-PHAGEN
23
1.1.15.1.
AMPLIFIZIEREN
UND
AUSPLATTIEREN
VON
X-PHAGEN
23
1.1.15.2.
AMPLIFIZIERUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
C-DNS
IN
X-ZAP-PHAGEN
23
1.1.16.
AUSPLATTIEREN
DER
X-PHAGEN-BANK,
FREISETZUNG UND
IMMOBILISIERUNG
DER
X-PHAGEN-DNS
24
1.1.17.
HYBRIDISIERUNG
25
-II
1.1.17.1.
HYBRIDISIERUNG
VON
X
PHAGEN-DNS
AUF
NITROZELLULOSE
FILTERN
25
1.1.18.
HYBRIDISIERUNG
VON
DNS
AUS
E.CO//-ZELLEN,
DIE
EIN
TRANSFORMIERTES
PLASMID
TRAGEN
27
1.1.19.
ALKALISCHER
TRANSFER
VON
DNS
AUF
EINE
MEMBRAN
(SOUTHERN-BLOT)
27
1.1.20.
AUFTRENNUNG
VON
BOTEN-RNS
(MRNS)
UND
ANSCHLIE
SSENDER
TRANSFER
AUF
EINE
MEMBRAN
(NORTHERN-BLOT)
28
1.1.21.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRANG-DNS
30
1.1.22.
SEQUENZIERGELE
31
1.1.23.
RNS-PRAEPARATION
AUS
RATTENGEWEBE
32
1.1.24.
DNS-VERVIELFAELTIGUNG
DURCH
EINE
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION
32
1.1.24.1.
METHODIK
32
1.1.24.2.
VERVIELFAELTIGUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
CDNS-SEQUENZ
MIT
DER
PCR
33
1.1.25.
IN
VIVO
FREISETZUNG
VON
INSERTIERTER
DNS
AUS
DEM
X-ZAP
II
VEKTOR
34
2.
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
36
2.1.
ABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE
36
2.2.
UV-DIFFERENZSPEKTROSKOPIE
36
2.3.
ZIRKULARDICHROISMUS
36
2.4.
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
36
3.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
37
3.1.
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
37
3.1.1.
VERDAU
VON
PROTEINEN
AUF
DER
TRANSFERMEMBRAN
37
3.1.2.
VERDAU
MIT
V8-PROTEASE
38
3.1.3.
VERDAU
MIT
TRYPSIN
38
3.1.4.
VERDAU
MIT
ASP-ENDOPROTEINASE
38
3.1.5.
VERDAU
MIT
BNPS-SKATOL
38
3.2
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
39
3.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
39
3.3.1.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE
NACH
LAEMMLI,
1970)
39
3.3.2.
TRIZIN-POLYACRALAMID-GELELEKTROPHORESE
(TRIZIN
PAGE,
SCHAEGGER
&
JAGOW,
1987)
41
3.4.
AMINOSAEUREANALYSE
43
3.5.
SEQUENZANALYSE
44
3.6.
CHEMISCHE
PROTEINMODIFIKATIONEN
44
3.6.1.
VINYLPYRIDINMODIFIKATION
44
3.6.2.
ACRYLODANMARKIERUNG
VON
S100P
44
3.6.3.
ACRYLODANMARKIERUNG
DES
PEPTIDS
ACL-18
45
3.6.4.
ACETYLIERUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOFUNKTION
45
3.7.
CHEMISCHE
KREUZVEMETZUNG
45
-III
3.7.1
CHEMISCHE
KREUZVERNETZUNG
MIT
EGS
(ETHYLEN
GLYCOLBIS-FSUCCINIMIDYLSUCCINAT])
45
3.7.2.
CHEMISCHE
KREUZVERNETZUNG
MIT
DST
(DISUCCIN
IMIDYL-TARTRAT)
46
3.7.3.
CHEMISCHE
KREUZVERNETZUNG
MIT
EDC
/
NHS
(ETHYL-3-(3-DIMETHYLAMINIPROPYL)-CARBODIIMID-HCL,
N-HYDROXYSULFOSUCCINIMID)
46
3.8.
EINSTELLUNG
DER
CA
2+
-KONZENTRATION
IM
PM
MOLAREN
BEREICH
46
3.9.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
47
3.9.1.
PRODUKTION
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
47
3.9.2
TITERBESTIMMUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
47
3.10
PROTEIN-TRANSFER
48
3.11.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
ANTIKOERPER
(WESTERN-BLOT)
48
4.0
AUFREINIGUNG
VON
ANNEXINEN
AUS
RINDERLUNGE
49
HL
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
51
1.
VORBEMERKUNG
51
1.1.
SUCHE
NACH
EINEM
ANNEXIN
I-LIGANDEN
53
1.1.1.
HERSTELLUNG
EINER
AFFINITAETSMATRIX
53
1.1.2.
ANREICHERUNG
VON
PROTEINEN,
DIE
CA
2+
-ABHAENGIG
AN
DIE
AFFINITAETSMATRIX
BINDEN
54
1.1.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
ACL-16(ANXI)-BINDENDEN
PROTEINE
55
1.1.4.
NAMENSGEBUNG
56
2.
SLOOP-CDNS-KLONIERUNG
57
2.1.
AMPLIFIZIERUNG
DER
S100P-CDNS-TEILSEQUENZ
DURCH
PCR
57
2.1.1.
SOUTHERN-BLOT
ANALYSE
DER
PCR-FRAGMENTE
58
2.3.
NUKLEOTIDSEQUENZBESTIMMUNG
DES
132-BASENPAAR
FRAGMENTS
59
2.4.
ABSUCHEN
(SCREENING)
DER
MENSCHLICHEN
PLAZENTA
CDNS-BANK
NACH
DEM
VOLLSTAENDIGEN
SLOOP-KLON
60
2.5.
ANALYSE
DER
POSITIVEN
KLONE
61
2.6.
EXPRESSION
DER
MENSCHLICHEN
SLOOP-CDNS
IN
E.COLI
64
2.6.1.
AUSWAHL
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
64
2.6.2.
KLONIERUNG
DER
SLOOP-CDNS
IN
DEN
EXPRESSIONS
VEKTOR
PKK
223-3
64
2.6.3.
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
S100P
67
3.1.
CHARAKTERISIERUNG
DES
GEREINIGTEN
REKOMBINANTEN
S100P
68
3.1.1.
SEQUENZIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
S100P
68
3.1.2.
DAS
UV-ABSORPTIONSSPEKTRUM
DES
REKOMBINANTEN
S100P
68
3.1.3.
DAS
CD-SPEKTRUM
DES
REKOMBINANTEN
S100P
69
-IV
3.1.5.
DIE
CA
2+
-BINDESTELLEN
IN
S100P
72
3.1.5.1,
MODIFIZIERUNG
DES
CYSTEIN
85
IN
S100P
MIT
PRODAN
73
3.I.5.2.
FLUORESZENZMESSUNGEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
CA
2+
-AFFINITAET
74
3.I.5.3.
UV-DIFFERENZSPEKTRUM
77
4.
IDENTIFIZIERUNG
VON
KONTAKTSTELLEN
IM
SLOOP-DIMER
79
4.1.
DELETION
DER
FUENF
C-TERMINALEN
AMINOSAEURERESTE
DES
S1OOP
DURCH
V8-PROTEASE
82
5.
DIE
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
S1OOP
83
5.1.
NORTHERN-BLOT
ANALYSE
83
5.2.
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
84
6.
SUCHE
NACH
EINEM
MOEGLICHEN
LIGANDEN
DES
S1OOP
86
6.1.
CHARAKTERISIERUNG
EINER
MOEGLICHEN
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
DEM
N-TERMINALEN
ANNEXIN
I-PEPTID
ACL-16(ANXL)
UND
S1OOP
86
6.2.
UEBERTRAGUNG
DES
PLL-ANNEXIN
11-BINDUNGSMODELL
AUF
S1OOP
87
6.2.1.
VORUEBERLEGUNG
87
6.2.2.
DER
ANNEXIN
II-N-TERMINUS
(ACL-18(ANXII)
PRODAN
)
BINDET
CA
2+
-ABHAENGIG
AN
S1OOP
88
6.2.3.
STOECHIOMETRIE
DER
KOMPLEXBILDUNG
90
6.2.4.
GELFILTRATION
DES
S100P-ACL-18(ANXLI)
KOMPLEXES
91
6.2.5.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SLOOP-BINDUNGSDOMAENE
FUER
DAS
ACL-18(ANXLL)-PEPTID
93
6.2.5.I.
MODIFIZIERUNG
VON
S1OOP
AM
CYSTEIN
85
94
6.2.5.2.
WECHSELWIRKUNG
DES
ACL-18(ANXLL)
PRODM
MIT
DEN
S100P.
MVTTCO
95
6.2.6.
BEI
BILDUNG
DES
S1OOP
/
ACL-18(ANXIL)-KOMPLEXES
ERHOEHT
SICH
DER
HELIKALE
ANTEIL
97
7.
DIE
SUCHE
NACH
EINEM
ZELLULAEREN
LIGANDEN
VON
S1OOP
98
7.1.
REINIGUNG
VON
ANNEXIN
I
AUS
RINDERLUNGE
101
7.2.
KREUZVERNETZUNG
VON
S1OOP
MIT
ANNEXIN
I
102
8.
HYDROPHOBIZITAET
ALS
ANTRIEBSKRAFT
DER
SLOO-LIGAND
WECHSELWIRKUNG
103
8.1.
PLL-BINDUNG
AN
PHENYLSEPHAROSE
103
8.2.
IM
PLLZACL-18(ANXII)-KOMPLEX
SIND
DIE
HYDROPHOBEN
AMINOSAEUREN
ABGESCHIRMT
104
8.3.
PHENYLSEPHAROSE
VERDRAENGT
EIN
MUTIERTES
ACL-18(ANXII)
PEPTID
AUS
DEM
PEPTID-PLL-KOMPLEX
106
8.4.
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEM
PLL
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
107
9.
ANALYSE
VON
STRUKTUR-FUNKTIONS-PRINZIPIEN
MIT
HILFE
VON
SLOOP-MUTANTEN-PROTEINEN
109
9.1.
VORUEBERLEGUNG
109
9.2.
AUSWAHL
DER
PROTEIN-MUTATIONEN
HO
9.3.
DIE
DELETIONSMUTANTEN
STOP95,
STOP90,
STOP88,
STOP86,
STOP84
110
-V
9.3.1.
EINFUEHRUNG
DES
TRANSLATIONS-TERMINIERUNGSSIGNALS
110
9.3.2.
AUFREINIGUNG
DER
STOP-MUTANTEN
113
9.3.3.
GELFILTRATION
DER
DELETIONSMUTANTEN
115
9.3.4.
FLUORESZENZSPEKTREN
DER
PRODAN-MARKIERTEN
DELETIONS
MUTANTEN
115
9.3.5.
TYROSIN-FLUORESZENZ
DER
DELETIONSMUTANTEN
119
IV.
DISKUSSION
124
1.
SYNTHESE
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
S100P
126
2.
DIE
SLOOP-LIGAND-WECHSELWIRKUNG
129
3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNG
133
4.
DIE
BEDEUTUNG
DES
C-TERMINUS
FUER
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
S1OOP
135
5.
STRUKTURMODELL
FUER
SLOO-PROTEINE
139
V.
ZUSAMMENFASSUNG
144
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
146 |
| any_adam_object | 1 |
| author | Becker, Tilmann |
| author_facet | Becker, Tilmann |
| author_role | aut |
| author_sort | Becker, Tilmann |
| author_variant | t b tb |
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| bvnumber | BV009779655 |
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