In-vitro-Mutagenese als Methode zur Analyse von Struktur-, Funktionsbeziehungen des humanen Interleukin-6 und des Einflusses von Interleukin-6 auf die humane alpha 2 -Makroglobulin-Expression:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSANGABE
SEITENZAHL
1
EINLEITUNG
1
1.1
IL-6:
EIN
PLEIOTROPES
MOLEKUEL
1
1.2
DIE
AKUTPHASE-REAKTION
4
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
MATERIAL
9
2.1.1
CHEMIKALIEN
9
2.1.2
LOSUNGEN
(2.1.2.1-2.1.2.55)
10
2.1.3
RADIOCHEMIKALIEN
18
2.1.4
BAKTERIENSTAEMME
18
2.1.5
GERAETE
19
2.2
METHODEN
20
2.2.1
ALLGEMEINES
ZUM
UMGANG
MIT
BAKTERIEN
UND
DEM
ML
3
PHAGEN
20
(A)
LAGERUNG
20
(B)
PHAGENTITER-BESTIMMUNG
UND
AUSPLATTIERUNG
20
2.2.2
PLASMID-AMPLIFIKATION
UND-ISOLIERUNG
21
(A)
IM
GROSSEN
MASSSTAB
21
(B)
IM
KLEINEN
MASSSTAB
23
2.2.3
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
23
(A)
BEHANDLUNG
MIT
CACL
3
23
(B)
TRANSFORMATION
24
2.2.4
RESTRIKTIONSANALYSEN
UND
MINIGEL-ELEKTROPHORESEN
24
2.2.5
SUBKLONIERUNG
25
(A)
A
UFARBEITUNG
DES
INSERIS
25
(B)
BEHANDLUNG
DES
VEKTORS
26
(C)
LIGATIONSANSATZ
27
2.2.6
ISOLIERUNG
VON
SSDNA
AUS
DEM
ML
3
PHAGEN
27
(A)
IM
KLEINEN
MASSSTAB
28
(B)
IM
GROSSEN
MASSSTAB
28
2.2.7
IN
VITRO
MUTAGENESE
29
(A)
ALLGEMEINES
29
(B)
REINIGUNG
UNI
PHOSPHORYLIERUNG
DES
OLIGONUKLEOTIDS
31
(C)
KONSTRUKTION
DER
GDDNA
32
(D)
AUJFILLLREAKTION
33
(E)
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
33
2.2.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
34
INHALTSVERZEICHNIS
SEITENZAHL
(A)
SEQUENZIER-REAKTION
34
(B)
SEQUENZIERGEL-ELEKTROPHORESE
36
2.2.9
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
36
2.2.10
IN
VITRO
TRANSLATION
38
2.2.11
SDS-PAGE
UND
AUTORADIOGRAPHIE
39
2.2.12
ALLGEMEINES
ZUR
ZELLKULTUR
40
2.2.13
B9-ZELL-PROLIFERATIONSTEST
41
2.2.14
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
HEPG2
ZELLEN
UND
IL-6-STIMULATION
42
2.2.15
CAT-ASSAY
42
(A)
ZELLAUFBRUCH
42
(B)
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
LOWRY/
SS-GALAKTOSIDASE-ASSAY
43
(C)
CAT-ASSAY
43
2.2.16
IMMUNPRAEZIPITATION
44
2.2.17
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
45
3
ERGEBNISSE
46
3.1
BASENAUSTAUSCH
IN
DER
IL-6-CDNA
46
3.1.1
UMKLONIERUNG
DER
IL-6-CDNA
IN
DEN
MI
3
PHAGEN
46
3.1.2
BASENAUSTAUSCH
TGG
AGG
(TRP
ARG)
48
3.1.3
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
UND
IN
VITRO
TRANSLATION
DES
MUTIERTEN
IL-6
51
3.1.4
EINSATZ
DES
MUTIERTEN
PROTEINS
IM
B9-ZELL-PROLIFERATIONSTEST
54
3.2
BASENAUSTAUSCH
IN
DER
PROMOTOR-REGION
DES
HUMANEN
O^M
55
3.2.1
UMKLONIERUNG
EINES
TEILS
DER
PROMOTOR
REGION
IN
DEN
MI
3
PHAGEN
55
3.2.2
BASENAUSTAUSCH
CAGGGA
CTGGGA
58
3.2.3
TRANSFEKTION
VON
CA
T-KONSTRUKTEN
DER
MUTIERTEN
ASSD-PROMOTOR-REGION
IN
HEPG2-ZELLEN
UND
AUS
WERTUNG
DER
RESULTIERENDEN
CA
T-AKTIVITAET
59
4
DISKUSSION
65
4.1
IN
VITRO
MUTAGENESE
IM
IL-6
65
4.2
IN
VITRO
MUTAGENESE
IM
HUMANEM
OTJM-PROMOTOR
67
5
ZUSAMMENFASSUNG
70
6
QUELLENVERWEISE
(1-68)
71 |
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