Untersuchungen zur Expression spannungsabhängiger Kalium-Kanäle im Nervensystem der Ratte:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKUERZUNGEN
S
HERKUNFT
DER
VERWENDETEN
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
6
1.
EINLEITUNG
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
12
MOLEKULARBIOLOGISCHE
GRUNDTECHNIKEN:
2.1
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
12
2.2
ISOLIERUNG
VON
KLONEN
AUS
X-BIBLIOTHEKEN
17
2.2.1
BESCHREIBUNG
DER
VERWENDETEN
BIBLIOTHEKEN
17
2.2.2
TITERBESTIMMUNG
DER
VERWENDETEN
BIBLIOTHEKEN
17
2.2.3
AUSPLATTIEREN
DER
BIBLIOTHEKEN
UND
HERSTELLUNG
DER
FILTERABZIIGE
17
2.2.4
ISOLIERUNG
VON
KLONEN
AUS
DEN
VERWENDETEN
BIBLIOTHEKEN
17
2.2.S
ISOLIERUNG
VON
X-DNA
AUS
KLEINEN
LYSATEN
18
2.2.6
ISOLIERUNG
VON
X-DNA
AUS
GROSSEN
LYSATEN
18
2.2.7
"IN
VIVO-EXCISION"
VON
X-ZAP2
KLONEN
19
2.3
PLASMID-ISOLIERUNG
19
2.3.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
2
ML
KULTUREN
19
2.3.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
100
ML
KULTUREN
19
2.4
RESTRIKTION
VON
DNA
20
2.S
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
20
2.6
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLON-MEMBRANEN
("SOUTHERN-BLOTTING")
20
2.7
KLONIERUNGSMETHODEN
20
2.7.1
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
20
2.7.2
PRAEPARATION
VON
KLONLERUNGS-VEKTOREN
21
2.7.3
LIGATION
21
2.7.4
PRAEPARATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
21
2.7.S
TRANSFORMATION
21
2.7.6
DNASE
I-DELETIONEN
22
2.8
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
22
2.8.
I
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
DNASE
I
22
UND
DNA-POLYMERASE
1
2.8.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
23
UND
DEM
KLENOW-FRAGMENT
DER
DNA-POLYMERASE
I
2.9
HYBRIDISIERUNG
AN
IMMOBILISIERTE
DNA
23
2.9.1
HYBRIDISIERUNG
UNTER
NIEDRIGER
STRINGENZ
23
2.9.2
HYBRIDISIERUNG
UNTER
HOHER
STRINGENZ
23
2.10
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
23
2.10.1
ISOLIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
DNA
23
2.10.2
SEQUENZIERUNG
VON
EINZELSTRAENGIGER
DNA
24
2.11
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UBER
SEPHADEX-SAEULEN
24
2.12
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
2S
2.12.1
STANDARD-PCR
2S
2.12.2
AMPLIFIZIERUNG
VON
CDNA-ENDEN
MIT
PCR
(RACE)
25
2.13
ISOLIERUNG
VON
RNA
26
2.13.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
26
2.13.2
ISOLIERUNG
VON
POLY
A*-RNA
26
2.14
TRANSFER
VON
RNA
AUF
NYLON-MEMBRANEN
("NORTHERN-BLOTTING")
26
2.1S
HERSTELLUNG
VON
RIBOPROBEN
26
2.16
HYBRIDISIERUNG
AN
IMMOBILISIERTE
RNA
27
HPLC.
2.17
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
"REVERSED
PHASE"
HPLC
27
2.18
REINIGUNG
VON
SYNTHETISCHEN
PEPTIDEN
MIT
"REVERSED
PHASE"
HPLC
27
IN
SFTU-HYBRLDLSLERUNG:
2.19
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
AN
GEWEBESCHNITTEN
UND
ZELLKULTUREN
28
2.19.1
PRAEPARATION
VON
RATTEN-GEWEBE
28
2.19.2
BESCHICHTEN
VON
OBJEKTTRAEGERN
28
2.19.3
ANFERTIGUNG
UND
FIXIERUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
28
2.19.4
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SONDEN
29
2.19.5
DURCHFUEHRUNG
DER
HYBRIDISIERUNG
29
2.19.6
AUTORADIOGRAPHIE
29
2.19.7
ANFAERBUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
(NISSL-FAERBUNG)
29
2.19.8
NACHWEIS
VON
CHOLINESTERASE-AKTIVITAET
IN
GEWEBE
30
IMMUNOLOGISCHE
UND
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN:
2.20
UBEREXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
BAKTERIELLEN
FUSIONSPROTEINEN
30
2.20.1
BESCHREIBUNG
DER
VERWENDETEN
EXPRESSIONSSYSTEME
30
2.20.2
INDUKTION
VON
2
ML
KULTUREN
30
2.20.3
INDUKTION
VON
500
ML
KULTUREN
31
2.20.4
AUFREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
31
2.21
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
31
2.22
GEWINNUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
31
2.22.1
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
GEGEN
BAKTERIELLE
FUSIONSPROTEINE
31
2.22.2
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
GEGEN
PEPTIDE
32
2.23
AFFINITAETSREINIGUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
32
2.24
ELISA
33
2.2S
PRAEPARATION
VON
MEMBRAN-PROTEINEN
AUS
RATTENHIRN
33
2.26
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE-MEMBRANEN
33
(
"WESTERN-BLOTTING")
2.27
IMMUNCYTOCHEMISCHE
FAERBUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
34
3.
ERGEBNISSE
35
3.1
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
KLONEN
DER
RAW-FAMILIE
35
3.2
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
KLONEN
DER
RAX-FAMILIE
38
3.3
IN
S/TU-HYBRIDISIERUNGEN
AN
GEWEBESCHNITTEN
UND
ZELLKULTUREN
42
3.3.1
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
IM
RATTENGEHIRN
42
3.3.2
EXPRESSION
ALTERNATIV
GESPLEISSTER
TRANSKRIPTE
50
3.3.3
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
IN
GLIAZELLEN
54
3.3.4
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
WAEHREND
DER
ENTWICKLUNG
57
3.3.5
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
IN
HERZ
UND
MUSKEL
60
3.3.6
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
IN
DER
RETINA
62
3.3.7
EXPRESSION
VON
KALIUM-KANAELEN
IM
RUECKENMARK
63
3.4
GEWINNUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
RAW2
(KV3.1)
ANTIKOERPERN
64
3.5
GEWINNUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
RAWL
68
UND
KV3.2C-PEPTIDE
4.
DISKUSSION
71
5.
ZUSAMMENFASSUNG
80
6.
LITERATUR
81
7.
ANHANG
95
7.1
LISTE
DER
VERWENDETEN
PCR-PRIMER
95
7.2
LISTE
DER
VERWENDETEN
IN
SITU
HYBRIDISIERUNGSPROBEN
96
7.3
EXPRESSION
FREQUENIN
HOMOLOGER
TRANSKRIPTE
DER
RATTE
98
LEBENSLAUF,
VEROEFFENTLICHUNGEN
101 |
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