Differentielle Genaktivität in v-myc-transformierten Wachtelfibroblasten:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1
EINLEITUNG
1
1.1
ONKOGENE
TRANSFORMATION
1
1.2
MYC,
EIN
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
2
1.3
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERMETHODEN
4
2
ARBEITSMATERIAL
6
2.1
VERBRAUCHSMATERIALIEN
6
2.2
CHEMIKALIENVERZEICHNIS
7
2.3
ENZYME
9
2.3.1
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
9
2.3.2
SONSTIGE
ENZYME
9
2.4
REAGENZIENSYSTEME
UND
RADIONUKLEOTIDE
10
2.5
REAGENZIEN
FUER
DIE
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
10
2.6
SONSTIGE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
MATERIALIEN
10
2.7
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
11
2.8
MEDIEN
FUER
BAKTERIEN-,
BAKTERIOPHAGEN
UND
PLASMIDAUFZUCHT
13
2.9
BIOLOGISCHE
MATERIALIEN
13
2.9.1
BAKTERIENSTAEMME,
BAKTERIOPHAGEN
UND
PLASMIDE
13
2.9.2
EUKARYOTISCHE
ZELLEN
15
2.9.3
EUKARYOTISCHE
EXPRESSIONSVEKTOREN
15
2.10
PRIMER
16
2.11
PUFFER
UND
LOESUNGEN
16
3
ARBEITSMETHODEN
25
3.1
ALLGEMEINE
ARBEITSMETHODEN
DER
MOLEKULARBIOLOGIE
25
3.1.1
ISOLATION
EUKARYOTISCHER
DNA
AUS
FIBROBLASTEN
25
3.1.2
ISOLATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
25
3.1.2.1
PLASMIDMINIPRAEPARATION
26
3.1.2.2
PLASMIDGROSSPRAEPARATION
26
3.1.2.3
PLASMIDPRAEPARATION
MITTELS
UHRAZENTRIFUEGATION
27
3.1.3
ISOLATION
VON
BAKTERIOPHAGEN-DNA
28
3.1.3.1
MINIPRAEPARATION
VON
BAKTERIOPHAGEN-DNA
28
3.1.3.2
GROSSPRAEPARATION
VON
BAKTERIOPHAGEN-DNA
MITTELS
ULTRAZENTRIFUGATION
29
3.1.4
ISOLATION
EUKARYOTISCHER
RNA
AUS
FIBROBLASTEN
30
II
3.1.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
(PHOTOMETRIE)
31
3.1.6
DNA-VERDAU
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
31
3.1.7
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
31
3.1.8
GEWINNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
32
3.1.9
AUFERBEITEN
VON
RESTRIKTIONSFTAGMENTEN
ZUR
KLONIERUNG
32
3.1.9.1
AUFLULLREAKTION
MIT
KLENOW-FRAGMENT
32
3.1.9.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
33
3.1.9.3
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
33
3.1.10
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
ZUR
PLASMIDTRANSFORMATION
(HANAHAN
BAKTERIEN)
33
3.1.11
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
DURCH
PLASMIDE
34
3.1.12
UEBERTRAGEN
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
34
3.1.13
FILTERHYBRIDISIERUNGEN
3
5
3.1.13.1
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHERN
UND
SOUTHEM-BLOTS
(KLONIERTE
DNA)
35
3.1.13.2
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHEM-BLOTS
(GENOMISCHE
DNA)
35
3.1.13.3
HYBRIDISIERUNG
VON
RUNDFILTEM
(PHAGENSCREEN)
36
3.1.14
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
RNA
IN
AGAROSEGELEN
36
3.1.15
UEBERTRAGEN
VON
RNA
AUS
AGAROSEGELEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
36
3
1.16
HERSTELLUNG
VON
MRNA
AUS
GESAMT-RNA
37
3.1.17
PRAEPARATION
VON
CDNA-BANKEN
37
3.1.18
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
PLATTIERBAKTERIEN
3
8
3.1.19
BESTIMMUNG
VON
PHAGENTITEM
39
3.1.20
AMPLIFIZIERUNG
VON
GENBANKEN
39
3.1.21
UEBERTRAGUNG
VON
BAKTERIOPHAGEN-DNA
VON
PLATTEN
AUF
NITROCELLULOSE
FILTER
39
3.1.22
DNA
SEQUENZIERUNG
40
3.1.23
POLYACRYLAMID-SEQUENZGELE
41
3.1.24
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
42
3.1.25
BEHANDLUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
NACH
DER
SYNTHESE
42
3.1.25.1
ABSPALTUNG
VOM
SAEULENMATERIAL
UND
VON
SCHUTZGRUPPEN
42
3.1.25.2
ENTSALZUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
AUF
RP18-SAEULEN
43
3.1.26
SILANISIERUNG
43
3.1.27
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
43
3.1.28
RADIOAKTIVE
MARKIERUNGSTECHNIKEN
44
3.1.28.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
RANDOMPRIMING
44
3.1.28.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
DURCH
M'CFC-TRANSLATION
44
3.1.28.3
OLIGONUKLEOTIDMARKIERUNG
45
3.1.28.4
HERSTELLUNG
VON
CDNA-PROBEN
MIT
HOHER
SPEZIFISCHER
AKTIVITAET
45
3.1.28.5
HERSTELLUNG
VON
CDNA-PROBEN
MIT
GERINGER
SPEZIFISCHER
AKTIVITAET
46
III
3.1.29
CHROMATOGRAPHISCHE
VERFAHREN
47
3.1.29.1
G50-GELFILTRATION
ZUR
ABTRENNUNG
VON
NUKLEOTIDEN
UND
ZUR
UMPUFFERUNG
47
3.1.29.2
S-300-SEPHACRYL-5PN
COLUMN
CHROMATOGRAPHIE
ZUR
UMPUFFERUNG
47
3.1.30
PRIMER-EXTENSION
48
3.1.31
57?/LC-PROTOKOLL
48
3.1.32
MUTAGENISIERUNG
MITTELS
TRANSFORMER
SITE-DIRECTED
MUTAGENESIS
KIT
49
3.2
ANGEWANDTE
METHODEN
IN
DER
ZELLKULTUR
51
3.2.1
KULTUR
VON
FIBROBLASTENZELLEN
51
3.2.2
TRYPSINISIERUNG
VON
FIBROBLASTENZELLEN
52
3.2.3
ZAEHLUNG
VON
ZELLEN
IM
COULTER
COUNTER
52
3.2.4
TRANSFIZIERUNG
VON VEKTOR-DNA
IN
FIBROBLASTENZELLEN
(CALCIUMCHLORID
METHODE)
53
3.2.5
EINFRIEREN
VON
FIBROBLASTENZELLEN
53
3.3
SPEZIELLE
ARBEITSMETHODEN
ZUR
AUFFINDUNG
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTER
GENE
54
3.3.1
UEBERPRUEFUNG
DER
QUALITAET
EINER
CDNA-BANK
54
3.3.2
UEBERPRUEFUNG
DER
QUALITAET
VON
MRNA
54
3.3.3
UEBERPRUEFUNG
ERFOLGREICHER
CDNA-SYNTHESEN
55
3.3.4
CDNA/MRNA-HYBRIDISIERUNG:
STANDARDISIERUNG
DER
BEDINGUNGEN
55
3.3.5
HYDROXYLAPATITSAEULENCHROMATOGRAPHIE:
TRENNUNG
VON
EINZEL
UND
DOPPELSTRAENGIGEN
NUKLEINSAEUREN
55
3.3.6
BESTIMMUNG
VON
SUBTRAKTIONSEFFIZIENZEN
57
3.3.7
RESCREENEN
VON
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTEN
KLONEN
(TRAEUFELTEST)
57
3.3.8
DAS
HERSTELLEN
EINES
SUBTRAKTIONSLABELS
58
3.3.9
DAS
HERSTELLEN
EINER
SUBTRAKTIONSBANK
60
3.4
VERWALTUNG
VON
SEQUENZDATEN
UND
HOMOLOGIEVERGLEICHE
60
4
ERGEBNISSE
61
4.1
DIE
BEDINGUNGEN
61
4.1.1
TRANSFORMIERTE
WACHTELFIBROBLASTEN
61
4.1.2
STANDARDISIERUNG
DER
SUBTRAKTIONSBEDINGUNGEN
66
4.2
SCREEN
NACH
GENEN,
DIE
IN
Q8-ZELLEN
UEBEREXPRIMIERT
SIND
69
4.2.1
KONSTRUKTION
EINER
SUBTRAKTIONSBANK
(Q8-QEF)
69
4.2.2
DER
KLON
WSNOTL
(WACHTEL-ANNEXIN
IV)
69
4.2.3
SCREEN
DER
SUBTRAKTIONSBANK
MIT
SUBTRAHIERTEN
PROBEN
74
4.2.4
DIE
KLONE
WS2
UND
WS3:
WACHTEL
CYSTATIN
74
4.2.5
DER
KLON
WS5:
EINE
Q8-SPEZIFISCHE
CDNA
75
4.2.6
DIE
KLONE
WS7
UND
WS17:
DAS
LIPOKALIN
Q83
76
4.2.7
DER
KLON
WS14:
LTR-SEQUENZEN
78
4.3
SCREEN
NACH
IN
Q8
SUPPRIMIERTEN
GENEN
78
IV
4.3.1
KONSTRUKTION
EINER
QEF
CDNA-BANK
,
.
.
78
4.3.2
YY
YY
SCREENEN
DER
CDNA-BANK
MIT
SUBTRAKTIVEN
PROBEN
79
4.3.3
DER
KLON
W4:
WACHTEL-OSTEONECTIN
80
4.3.4
DER
KLON
W23:
FUSION
ZWEIER
CDNAS
85
4.3.4.1
DER
KLON
W23O:
WACHTEL-NOV
85
4.3.4.2
DER
KLON
W23U:
WACHTEL
PROA-KOLLAGEN
TYP
I
(II)
89
4.3.5
DER
KLON
W15:
WACHTEL-?CRP2,
EIN
TRANSFONNATIONMARKER?
92
4.3.5.1
ANALYSE
DER
CDNA
VON
W15
95
4.3
5.2
PRIMER-EXTENSION
ZUR
FESTLEGUNG
DES
TRANSKRIPTIONSSTARTS
VON
QCRP2
98
4.3.5.3
5'
RACE
ZUR
KLONIERUNG
DES
5'-ENDES
VON
QCRP2
99
4.3.5.4
ISOLATION
GENOMISCHER
KLONE,
DER
^CRP2-PROMOTER
100
4.3.5.5
QCRP2,
EIN
VERTRETER
DER
LIM-FAMILIE
103
4.3.5.6
QCRPL,
EIN
WEITERER
VERTRETER
DER
LIM-FAMILIE
106
4.3.5.7
DIE
CRP-PROTEINE,
EINE
NEUE
GENFAMILIE
HO
4.3.5.8
INVIVO-UNTERSUCHUNGEN
ZUR
TRANSFORMATIONSSPEZIFITAET
VON
QCRP2
111
4.3.5.8.1
EXPRESSION
VON
QCRP2
IN
TSLA29-TRANFIZIERTEN
QEF-ZELLEN
112
4.3.5.8.2
RC
ASW
1
5-EXPRESSIONSKONSTRUKTE
114
4.3.6
W8:
EIN
TRANSKRIPTIONSFAKTOR?
117
4.3.7
W35:
AKTIN-DEPOLYMERSISIERUNGS-FAKTOR
118
4.4
AMINOSAEURE
336
AUS
V-MYC:
MUTAGENISIERUNG
EINER
FUNKTIONELLEN
DOMAENE
119
4.4.1
MUTAGENISIERUNG
DES
HISTIDINS
336
IN
PETWTAB
120
4.4.2
AUSTAUSCH
DES
HISTIDINS
336
IN
RCASWTMYC
120
5
DISKUSSION
123
6
ZUSAMMENFASSUNG
127
7
LITERATURVERZEICHNIS
128
8
ANHANG
140 |
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