Untersuchungen zur Ausprägung der Connexingene während der Embryonalentwicklung der Maus:
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
1.1 GAP JUNCTIONS.1
1.2 AUFBAU DES GAP JUNCTION KANALS.2
1.3 DIE CONNEXIN-GEN- UND PROTEIN-FAMILIE.3
1.4 DIE TOPOLOGIE DER CONNEXINE.3
1.5 GENOMI SEHE ORGANISATION DER CONNEXINE.5
1.6 REGULATION DER INTERZELLULAEREN KOMMUNIKATION.5
1.6.1
TRANSKRIPTION DER CONNEXIN-GENE.6
1.6.2 SIGNAL-KASKADEN UND PHOSPHORYLIERUNG.6
1.6.3 ZELLULAERER TRANSPORT UND ZUSAMENBAU VON CONNEXINEN.7
1.6.4 HOMOLOGE UND HETEROLOGE KOPPLUNG VON CONNEXINEN.7
1.7 GAP JUNCTIONS UND WACHSTUMSKONTROLLE.8
1.8 DIE GAP JUNCTION VERMITTELTE INTERZELLULAERE
KOMMUNIKATION IN DER EMBRYONALENTWICKLUNG.9
1.8.1
GRADIENTEN DER CONNEXIN-AUSPRAEGUNG IN EMBRYONALEN GEWEBEN.9
1.8.2 KOMMUNIKATIONSBEREICHE IM FRUEHEN MAUSEMBRYO.11
1.8.3 KONZEPT DER ENTWICKLUNGSBEREICHE.11
1.8.4 KORRELATION ZWISCHEN KOMMUNIKATIONS-UND ENTWICKLUNGSBEREICHEN.12
1.8.5 MORPHOLOGISCHE GRUNDLAGEN VON KOMMUNI KATIONSBEREICHEN.13
1.9 ZIELSETZUNGEN DER VORLIEGENDEN ARBEIT.13
2. VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN.16
3. MATERIAL.17
3.1 CHEMI KAL I EN.17
3.2 STAMMLOESUNGEN, PUFFER UND GEBRAEUCHLICHE ENZYME.17
3.3 MEDIEN FUER DIE PHAGEN- UND BAKTERIENKULTUR.20
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/941521664
3.4 MEDIEN FUER DIE KULTUR VON SAEUGERZELLEN.22
3.5 ZELLINIEN.23
3.6 BAKTERIENSTAEMME.23
3.7 PLASMIDE.23
3.8 OLIGONUKLEOTIDE.24
3.9 GENBANKEN.24
4. METHODEN.25
4.1 METHODEN DER ZELLKULTUR.25
4.1.1 KULTIVIERUNG UND PASSAGIERUNG VON F9-TERATOKARZINOM ZELLEN.25
4.1.2 F9-EINZELKLONISOLIERUNG DURCH "ABSAUGEN" MIT EINER
GLASKAPILLARE.25
4.1.3 DIFFERENZIERUNG VON F9-ZELLEN UNTER DEM EINFLUSS VON
RETINSAEURE.26
4.2
IN SITU
HYBRIDISIERUNG.27
4.2.1 TIERHALTUNG UND PRAEPARATION VON MAUSORGANEN BZW.
MAUSEMBRYONEN.27
4.2.2 ANFERTIGUNG VON GEFRIERSCHNITTEN.27
4.2.3 BESCHICHTUNG VON OBJEKTTRAEGERN MIT POLY-L-LYSIN.27
4.2.4 FIXIERUNG UND LAGERUNG DER DUENNSCHNITTE.28
4.2.5 VORHYBRIDISIERUNG DER FIXIERTEN DUENNSCHNITTE.28
4.2.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON ANTI-SINN
OLIGONUKLEOTIDEN UND HYBRIDISIERUNG AN MRNS
IN SITU
.28
4.2.7 WASCHSCHRITTE ZUR ENTFERNUNG VON
UEBERSCHUESSIGER PROBE UND TESTEXPOSITION DER SCHNITTE.29
4.2.8 MIKROAUTORADIOGRAPHIE.
30
4.2.9 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG UND DOKUMENTATION.31
4.3 IMMUNOF LUORESZENZ-ANALYSEN.
31
4.3.1 SCHNITTE FUER IMMUNOFLUORESZENZ-ANALYSEN ANFERTIGEN.31
4.3.2 ANTIKOERPER-INKUBATION UND FLUORESZENZ-ANALYSE.
YY
.31
4.4 GRUNDLEGENDE MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN.32
4.5 DURCHMUSTERUNG VON GENBANKEN.32
4.5.1 SELEKTIVE ANREICHERUNG UND ISOLIERUNG VON
PHAGEN-KLONEN DURCH PLAQUE-HYBRIDISIERUNG.32
4.5.2
LAMBDA-LFIP IN VIVO
AUSCHNITTSMETHODE.33
4.6 DNS-PRAEPARATIONEN.34
4.6.T PLASMID-DNS PRAEPARATION ("MINIPRAEP").34
4.6.2 PLASMID-DNS PRAEPARATION FUER PRAEPARATIVE ZWECKE ("MIDIPRAEP").35
4.6.3 DNS-ISOLIERUNG AUS LABCTE-PHAGEN.35
4.6.4 PRAEPARATION UND VERDAU GENOMISCHER DNS.37
4.7 AUFREINIGUNG VON DNS-LOESUNGEN.37
4.7.1 PLASMID-REINIGUNG UEBER CSCL-
G1 EI CHGEWI CHTSGRADI ENTEN-ZENT R I F UGAT ION.37
4.7.2 DNS-REINIGUNG UEBER IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN.38
4.7.3 ISOLIERUNG VON DNS-FRAGMENTEN AUS NIEDRIG
SCHMELZENDEN AGAROSEGELEN MIT PHENOL- ODER QUIAEX-REINIGUNG.38
4.8 DNS-REKOMBINATION UND TRANSFORMATION.39
4.8.1 VOLLSTAENDIGE UND PARTIELLE RESTRIKTION VON DNS.39
4.8.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNS.40
4.8.3 GLAETTEN VON DNS-FRAGMENTEN.40
4.8.4 LIGATION VON PASSAGIER-DNS UND VEKTOR-DNS.40
4.8.5 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN IN EINEM EINZIGEN PUFFERSYSTEM.41
4.8.6 HERSTELLUNG KOMPETENTER BAKTERIEN UND TRANSFORMATION.42
4.8.7 SELEKTION REKOMBINANTER KLONE DURCH DEN "BLAU/WEIB" TEST.42
4.8.8 KLONSELEKTION DURCH "TURBO-SCREENING".43
4.8.9 HERSTELLUNG VON DELETIONSMUTANTEN.43
4.9 DNS-SEQUENZIERUNG.44
4.10 RADIOAKTIVE UND NICHT-RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNS.46
4.10.1 ZUFALLS-START METHODE ("RANDOM PRIMING").46
4.10.2 5'- UND 3'- MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN.46
4.10.3 DIGOXIGENIN-MARKIERUNG VON DNS.47
4.11 RNS PRAEPARAT ION.48
4.12 ELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN.49
4.12.1 NATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNS.49
4.12.2 DENATURIERENDE POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE.49
4.12.3 DENATURIERENDE RNS-GELELEKTROPHORESE.51
4.13 UEBERTRAGUNG VON NUKLEINSAEUREN AUF NYLON-MEMBRANEN.52
4.13.1 KAPILLARBLOT.52
4.13.2 VAKUUMBLOT.52
4.13.3 DNS- UND RNS- TROPF-BLOT.53
4.14 HYBRIDISIERUNG VON FILTERGEBUNDENEN NUKLEINSAEUREN.54
4.14.1 RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG.54
4.14.2 NICHT-RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG MIT DIGOXIGENIN
MARKIERTEN PROBEN UND CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS.55
4.15 TRANSKRIPTANALYSEN.56
4.15.1 RELATIVE BESTIMMUNG DES POLY A
+-GEHALTS EINER RNS-PRAEPARATION.56
4.15.2 AUSWERTUNG VON NORTHERNBLOT-ANALYSEN:
TRANSKRIPTLAENGEN UND GLEICHGEWICHTSMENGEN.57
4.15.3 RNASE-SCHUTZEXPERIMENT.57
4.15.4 REVERSE TRANSKRIPTION UND POLYMERASE KETTENREAKTION.58
5. ERGEBNISSE.60
TEIL A: MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG UND MANIPULATION
VON MITGLIEDERN DER CONNEXIN-GENFAMILIE.60
5.1 KLONIERUNG DES CX30.4- UND CX31-GENS DER MAUS.60
5.1.1 CHARAKTERISIERUNG VON CONNEXIN-IDENTISEHEN
PHAGENLYSATEN EINER GENOMISEHEN MAUSBANK.60
5.1.2 SEQUENZIERUNG DES CONNEXIN30.4-GENS.61
5.1.3 DAS CX30.4-GEN LIEGT ALS EINZELKOPIE IM MAUSGENOM VOR.62
5.1.4 CX30.4 MRNS WIRD IM ADULTEN MAUSGEHIRN UND IN HAUT AUSGEPRAEGT.63
5.2 ISOLIERUNG EINER CX31.1 CDNS AUS
EINER F9 TERATOKARZINOM CDNS-BANK.65
5.2.1 RNASE SCHUTZEXPERIMENT ZUR UEBERPRUEFUNG
DER KLONIERTEN CX31.1 CDNS.66
5.2.2 BESTIMMUNG DER EXON/INTRON GRENZEN IM CX31.1 GEN
UND LOKALISATION DER POLYADENYLIERUNGSSTELLE.67
5.3 DER ERSTE NACHWEIS ALTERNATIVEN SPLEIBENS VON CONNEXIN-
TRANSKRIPTEN: DAS ALTERNATIVE CONNEXIN32 TRANSKRIPT.70
5.3.1 ISOLIERUNG VON CDNS-MOLEKOELEN DES VOLLSTAENDIGEN
ALTERNATIVEN CONNEXIN32 TRANSKRIPTS AUS F9-ZELLEN.70
5.3.2 DIE AUSPRAEGUNG DES NORMALEN UND ALTERNATIVEN CX32 TRANSKRIPTS
IN F9-ZE11EN WIRD UNTERSCHIEDLICH DURCH RETINSAEURE REGULIERT.72
5.4 GEZIELTER AMI NOSAEURE-AUSTAUSCH INNERHALB
DER AMPHIPHILEN HELIX DES MAUS CONNEXIN37 PROTEINS.74
5.4.1 DER ADENIN-THYMIN AUSTAUSCH IN DER MONIERTEN CX37 CDNS
BERUHT NICHT AUF EINER RNS-"EDITIERUNG".74
5.4.2 KLONIERUNG DES CONNEXIN37-METHIONIN TRANSKRIPTIONSVEKTORS.75
5.4.3 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN DES METHIONIN-KLONS.75
TEIL B: STUDIEN ZUR AUSPRAEGUNG DER CONNEXIN-GENFAMILIE
IN DER EMBRYONALENTWICKLUNG DER MAUS.77
5.5 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN IM PRAE-IMPLANTATIVEN MAUSEMBRYO.77
5.5.1 CX31- UND CX43-PROTEIN WERDEN BEIDE
IN 3.5 DPC BLASTOZYSTEN AUSGEPRAEGT.77
5.6 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN IM POST-IMPLANTATIVEN MAUSEMBRYO.78
5.6.1 NACH DER IMPLANTATION DES MAUSEMBRYOS ERFOLGT EINE
STRIKTE ABGRENZUNG DER CX31 UND CX43 AUSPRAEGUNG.78
5.6.2 AUSPRAEGUNG WEITERER CONNEXINE IM 7.5 DPC MAUSEMBRYO.81
5.7 EINFLUSS VON RETINSAEURE UND CAMP AUF DIE CONNEXIN-AUSPRAEGUNG
IN UNDIFFERENZIERTEN UND DIFFERENZIERTEN F9-ZELLEN.82
5.7.1 DIE DIFFERENZIERUNG VON F9 ZELLEN ZU VISZERALEN ENTODERM
IST BEGLEITET VON EINER ZUNAHME DER CX43MRNS UND EINER
ABNAHME DER CX31 .82
5.7.2 EINFLUSS VERSCHIEDENER RETINSAEURE-KONZENTRATIONEN AUF DIE
CONNEXIN-AUSPRAEGUNG ANGEHEFTET WACHSENDER F9-ZELLEN.84
5.8 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN IN DER FOETALEN MAUSENTWICKLUNG.86
5.8.1 CONNEXIN40 IST EIN GAP JUNCTION PROTEIN DER
FOETALEN ENTWICKLUNG VON MUSKELN, GEFAESSEN UND HERZ.86
5.8.2 CONNEXIN43 WEIST EIN SEHR VIELFAELTIGES
AUSPRAEGUNGSMUSTER IN DER FOETALEN MAUSENTWICKLUNG AUF.90
5.8.3 CONNEXIN37 WIRD IN DEN ANLAGEN DER ZWISCHENWIRBEL SCHEIBEN
UND IM GEFAESSENDOTHEL DES FOETALEN MAUSEMBRYOS AUSGEPRAEGT.97
5.8.4 CONNEXIN45 WIRD IM NEUROEPITHEL
DES FOETALEN MAUSEMBRYOS AUSGEPRAEGT.99
5.9 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN IM FOETALEN UND ADULTEN MAUSHERZ.100
5.9.1 QUANTITATIVE NORTHERNBLOT-ANALYSEN.100
5.9.2 CX40 MRNS WIRD FOETAL BESONDERS STARK IN HERZREGIONEN
AUSGEPRAEGT, DIE NUR WENIG CX43 MRNS AUSPRAEGEN.V*.103
6. DISKUSSION.106
6.1 CONNEXIN30.4, EIN NEUES MITGLIED DER CONNEXIN GENFAMILIE, WIRD
BEVORZUGT IM ADULTEN GEHIRN UND ADULTER HAUT AUSGEPRAEGT.106
6.2 CHARAKTERISIERUNG EINER CX31.1 CDNS
AUS MAUS F9 TERATOKARZINOMZELLEN.107
6.3 ERSTER NACHWEIS ALTERNATIVEN SPLEISSENS
VON CONNEXI N-TRANSKRIPTEN.108
6.4 DIE ABFOLGE POLARER AMINOSAEURERESTE IN DER
3.TRANSMEMBRANDOMAENE DES CX37-PROTEINS IST BEDEUTUNGSVOLL
FUER DIE FUNKTION DIESES GAP JUNCTION KANALS.109
6.5 CX31 UND CX43 SIND GAP JUNCTION PROTEINE
DER FRUEHEN EMBRYONALENTWICKLUNG DER MAUS.HL
6.6 CX31 UND CX43 AUSPRAEGUNG IM POST-IMPLANTATIVEN MAUSEMBRYO:
BEZIEHUNG ZWISCHEN BEREICHEN DER CONNEXIN-AUSPRAEGUNG
UND BILDUNG VON KOMMUNIKATIONSBEREICHEN.112
6.7 DAS F9-ZEL1 SYSTEM ALS
IN VITRO
MODELL ZUM STUDIUM VON
DIFFERENZIERUNGSPROZESSEN UND CONNEXI N AUSPRAEGUNG.114
6.8 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN WAEHREND DER FOETALEN ORGANOGENESE.116
6.8.1 DIE AUSPRAEGUNG DES CX40 BEGINNT MIT DER ORGANOGENESE
VON MUSKELN, GEFAEBEN UND HERZ.116
6.8.2 CX43 WIRD IN DER FOETALEN MAUSENTWICKLUNG
SEHR VERBREITET AUSGEPRAEGT.117
6.8.3 IST CONNEXIN37 EIN ZIELGEN DES "PAIRED-BOX"-GENS PAX-1?.118
6.8.4 DIE NEURALE AUSPRAEGUNG DES CONNEXIN45 GENS.119
6.9 AUSPRAEGUNG VON CONNEXINEN I FOETALEN UND ADULTEN MAUSHERZ.119
7. ZUSAMMENFASSUNG.122
8. LITERATUR-VERZEICHNIS.124
9. ANHANG: KODIERENDE SEQUENZ DES MAUS CX30.4 GENS.139
10. EIGENE VEROEFFENTLICHUNGEN.141 |
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