Definition von Kriterien und Konstruktion von Rekombinationsplasmiden zur Expression der F- und G-Proteine des bovinen respiratorischen syncytialen Virus im bovinen Herpesvirus 1:
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| Format: | Buch |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
LISTE
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
8
ZUSAMMENFASSUNG
10
1.
EINLEITUNG
13
1.1
DIE
HERPESVIREN
13
1.1.1
MORPHOLOGISCHER
AUFBAU
DER
HERPESVIREN
13
1.1.2
GENOMSTRUKTUREN
13
1.1.3
DIE
REPLIKATION
DER
HERPESVIREN
15
1.1.4
DAS
BOVINE
HERPESVIRUS
1
(BHV-1)
17
1.2
DIE
PARAMYXOVIREN
19
1.2.1
MORPHOLOGISCHER
AUFBAU
DER
PARAMYXOVIREN
19
1.2.2
GENOMORGANISATION
UND
VIRUSPROTEINE
21
1.2.3
DIE
REPLIKATION
DER
PARAMYXOVIREN
23
1.2.4
DAS
BOVINE
RESPIRATORISCHE
SYNCYTIALE
VIRUS
25
(BRSV)
1.2.5
DAS
RSV/F
PROTEIN
28
1.2.6
DAS
RSV/G
PROTEIN
31
1.3
PROBLEMSTELLUNG
34
2.
ERGEBNISSE
37
2.1
SUCHE
NACH
EINEM
FUER
DIE
EXPRESSION
HETEROLOGER
38
GENE
IM
BHV-1
GENOM
GEEIGNETEN
PROMOTOR
38
2.1.2
DER
MCMVIE2/EPK
IM
BHV-1
GENOM
40
2.1.2.1
KONSTRUKTION
EINES
REKOMBINATIONSVEKTORS
FUER
DEN
MCMVIE2/EPK
UND
INTEGRATION
DES
KONSTRUKTS
IN
DAS
BHV-1/80-221
GENOM
40
2.1.2.2
GIV
EXPRESSION
DER
BHV-L/80-221-MCMVIE2/EPK-GIV
REKOMBINANTEN
46
2.2
REPETITIVE
N569
DNA
KANN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
VON
RESPIRATORISCHEN,
GENITALEN
UND
ENZEPHALITI-
SCHEN
STAEMMEN
VERWENDET
WERDEN
48
2.3
ANALYSE
DER
REPETITIVEN
EINHEITEN
UND
DER
UNIQUE
SHORT
SEQUENZ
VERSCHIEDENER
BHV-1
STAEMME,
EINSCHLIESSLICH
MSV
UND
HOT
52
2.3.1
KARTIERUNG
DER
REPETITIVEN
UND
UNIQUE
SHORT
REGION
VON
BSTEII
FRAGMENTEN
DER
GENOME
VERSCHIEDENER
BHV-1
STAEMME
MIT
BHV-1/N569
SONDEN
52
2.3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
HINDLLL-L
FRAGMENTE
VON
BHV-L/SCHOENBOEKEN,
MSV
UND
HOT
DNA
MIT
MARKIERTEN
BHV-L/SCHOENBOEKEN
PROBEN
56
2.3.3
KARTIERUNG
DER
SMAL
SCHNITTSTELLEN
DER
HINDLLL-L
FRAGMENTE
VON
BHV-L/SCHOENBOEKEN,
MSV
UND
HOT
58
2.4
KARTIERUNG
DES
VACCINEVEKTORS
MSV
62
2.4.1
ISOLIERUNG
DES
HINDLLL-L
FRAGMENTS
VON
BHV-L/MSV
62
2.4.2
PHYSIKALISCHE
KARTE
DER
HINDIN,
ECORI
UND
BSTEII
SCHNITTSTELLEN
DER
REPETITIVEN
EINHEIT
UND
DER
UNIQUE
SHORT
VON
BHV-L/MSV
UND
BHV-L/HOT
64
2.5
INTEGRATION
DES
SS-GALAKTOSIDASEGENS
IN
DAS
BHV
L/MSV
HINDIII-L
66
2.6
KONSTRUKTION
DER
REKOMBINATIONSVEKTOREN
ZUR
69
EXPRESSION
VON
BRSV/G
UND
F
2.6.1
KONZEPTION
UND
KLONIERUNG
DES
SYNTHETISCHEN
BRSV/G-ORF
70
2.6.1.1
KRITERIEN
ZUR
KONZEPTION
DES
SYNTHETISCHEN
BRSV/G-ORF
70
2.6.1.1.1
GC-GEHALT
70
2.6.1.1.2
WAHL
DER
SINGULAEREN
SCHNITTSTELLEN
71
2.6.1.1.3
ANALYSE
DER
CODONVERWENDUNG
IN
ORIGINALEM
UND
SYNTHETISCHEM
BRSV/G-ORF
73
2.6.1.2
KONSTRUKTION
DES
BRSV/GSYN-ORF
AUS
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
78
2.6.1.3
KLONIERUNG
DES
BRSV/GSYN-ORF
81
2.6.1.3.1
KLONIERUNG
DES
5
'-ENDES
DES
BRSV/GSYN-ORF
BIS
ZUR
AFLLL
SCHNITTSTELLE
IN
PUC18
82
2.6.1.3.2
KLONIERUNG
DES
3'
-ENDES
DES
BRSV/GSYN-ORF
BIS
ZUR
AFLLL
SPALTSTELLE
IN
PUC19
84
2.6.1.3.3
KLONIERUNG
DES
SYNTHETISCHEN
BRSV/G-ORF
AUS
PUC18-F
1-3
UND
PUC19-F
4-7
85
2.6.2
REKONSTRUKTION
DES
BHV-1/GIV
88
2.6.2.1
ISOLIERUNG
DES
BHV-L/GIV-ORF
88
2.6.2.2
INSERTION
DES
BHV-L/GIV-ORF
IN
PLAL-6
92
2.6.2.3
REKONSTRUKTION
DES
3
'-ENDES
DES
BHV-L/GIV-ORF
IN
93
PLAL-6-GIV-ORF
2.6.2.4
DAS
BHV-1/GIV
ERHAELT
DAS
MCMVIE2/POLY
A
97
2.6.2.5
INTEGRATION
DES
BHV-1/GIV
DES
PAT-GLV
IN
DAS
100
BHV-1/80-221
GENOM
DURCH
HOMOLOGE
REKOMBINATION
2.6.3
DER
BRSV/G-ORF
UND
DER
BRSV/F-ORF
ERHALTEN
DEN
102
PRV/GP50
PROMOTOR
2.6.4
KLONIERUNG
DER
BRSV
GENE
IN
PAT
108
3.
DISKUSSION
109
3.1
DER
VACCINEVEKTOR
BHV-L/MSV
111
3.2
DIE
WIRKSAMKEIT
DES
HETEROLOGEN
MCMVIE2
ENHANCER
113
PROMOTOR
KOMPLEXES
(MCMVIE2/EPK)
IM
BHV-1
GENOM
3.3
KONZEPTION
DES
REKOMBINATIONSVEKTORS
PAT-GLV
UND
116
INSERTION
DER
HETEROLOGEN
GENE
4.
MATERIALIEN
122
4.1
ZELLINIEN
122
4.2
VIRUSSTAEMME
122
4.3
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
UND
SEREN
122
4.4
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
122
4.5
OLIGONUKLEOTIDE
123
4.6
ENZYME
UND
NUKLEINSAEUREN
125
4.7
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
125
4.8
ANTIBIOTIKA
126
4.9
KITS
126
4.10
SOFTWARE
126
4.11
REAGENZIEN
126
4.12
GERAETE
128
4.13
VERBRAUCHSMATERIAL
129
5.
METHODEN
130
5.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
130
5.1.1
BAKTERIENKULTUR
130
5.1.2
ANLEGEN
EINER
BAKTERIENDAUERKULTUR
130
5.1.3
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI-STAEMME
FUER
DIE
130
TRANSFORMATION
5.1.4
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.COLI
BAKTERIEN
131
5.1.5
SCHNELLPRAEPARATION
BAKTERIELLER
PLASMID-DNA
131
5.1.6
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.COLI
132
5.1.7
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
134
5.1.8
SCHNELLPRAEPARATION
REKOMBINANTER
PLASMID-DNA
FUER
134
SEQUENZANALYSEN
5.1.9
ALKALISCHE
DENATURIERUNG
VON
DNA
135
5.1.10
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
NACH
135
SANGER
5.2
MANIPULATION
VON
NUKLEINSAEUREN
136
5.2.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
136
5.2.2
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
136
NUKLEINSAEUREN
5.2.3
AUFFUELLREAKTION
VON
5'
-UEBERSTEHENDEN
ENDEN
MIT
137
E.COLI
POLYMERASE
I
KLENOW-FRAGMENT
(KLENOW
POLYMERASE)
5.2.4
VERKUERZUNG
VON
LINEARER
DNA
DURCH
EXONUKLEASE
137
BAL31
5.2.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DNA
138
5.2.6
REINIGUNG
VON
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
138
5.2.7
HYBRIDISIERUNG
KOMPLEMENTAERER
OLIGONUKLEOTID
139
STRAENGE
5.2.8
LIGATION
140
5.3
GELELEKTROPHORESE
140
5.3.1
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
141
5.3.2
POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
VON
DNA
141
5.3.3
ELEKTROELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
GELEN
142
5.3.4
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
FUER
PROTEINE
142
5.4
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEURE
AUF
NITROCELLULOSE
UND
144
HYBRIDI
S
IERUNG
5.4.1
SOUTHERN-TRANSFER
144
5.4.2
KOLONIETRANSFER
144
5.4.3
DOT
BLOT
145
5.4.4
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DEM
RANDOM
PRIMED
DNA
LABELING
KIT
145
5.4.5
HYBRIDISIERUNG
146
5.5
ZELLKULTUR
UND
VIRUSINFEKTION
VON
ZELLEN
147
5.5.1
ZELLKULTUR
147
5.5.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
147
5.5.3
HERSTELLUNG
VON
VIRUSSUSPENSION
148
5.5.4
VIRUSTITRATION
148
5.6
VIRUSREKOMBINANTEN
DURCH
KOTRANSFEKTION
UNTER
VERWENDUNG
VON
KALZIUMPHOSPHAT
149
5.7
PRAEPARATION
VON
DNA
AUS
VIRUSINFIZIERTEN
ZELLEN
150
5.8
REINIGUNG
VIRALER
DNA
150
5.9
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
151
5.9.1
PRAEPARATION
VON
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
151
5.9.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
VIVO
152
5.9.3
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
152
6.
LITERATURVERZEICHNIS
154 |
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