Reinigung und Charakterisierung einer Phospholipase C aus Rattenleberzytosol:
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1993
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1
INHALTSVERZEICHNIS
1
1.1
ABKUERZUNGEN
4
2
EINLEITUNG
6
2.1
EINFUEHRUNG
IN
DIE
SIGNALTRANSDUKTION
6
2.1.1
SIGNALTRANSDUKTION
UEBER
G-PROTEINE
9
2.1.2
DAS
ADENYLYL-ZYKLASE-SYSTEM
10
2.2
DAS
PHOSPHOINOSITID-PHOSPHOLIPASE
C-SYSTEM
11
2.2.1
EINFUEHRUNG
11
2.2.2
PHOSPHOLIPASE
C
15
2.2.2.1
EINTEILUNG,
NOMENKLATUR
UND
PRIMAERSTRUKTUR
DER
PHOSPHOLIPASE
C-ISOENZYME
18
2.2.3
REGULATION
DER
PHOSPHOLIPASE
C
20
2.2.3.1
REGULATION
DER
PHOSPHOLIPASE
C
DURCH
REZEPTOREN
MIT
TYROSINKINASE-AKTIVITAET
21
2.2.3.2
REGULATION
DER
PHOSPHOLIPASE
C
DURCH
G-PROTEINE
24
3
ZIELSETZUNG
30
4
MATERIAL
&
METHODEN
31
4.1
MATERIAL
31
4.2
METHODEN
32
4.2.1
SYNTHESE
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SUBSTANZEN
32
4.2.1.1
SYNTHESE
VON
[5-32P]PTDINS(4,5)P2
32
4.2.1.2
SYNTHESE
VON
[5-32P]LNS(4)P
32
4.2.1.3
SYNTHESE
VON
[4-32P]PTDINS(L,4,5)P3
32
4.2.2
MESSUNG
DER
ENZYMAKTIVITAETEN
33
4.2.2.1
BESTIMMUNG
DER
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAET
33
4.2.2.2
BESTIMMUNG
DER
PTDINS(4,5)P2-5-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
35
4.2.2.3
BESTIMMUNG
DER
INS(L,
4,
5)PSS-5-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
35
4.2.3
HERSTELLUNG
VON
PHOSPHOLIPIDVESIKEL
36
4.2.4
EINSTELLUNG
DEFINIERTER
CA2+
UND
MG2+-KONZENTRATIONEN
36
4.2.5
NACHWEIS
VON
G-PROTEIN-UNTEREINHEITEN
MITTELS
WESTERN-BLOT
UND
AUTORADIOGRAPHIE
37
2
4.2.6
BESTIMMUNG
DES
STOKE'SEHEN
RADIUS
37
4.2.7
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
38
4.2.8
PROTEINBESTIMMUNG
39
4.2.8.1
BESTIMMUNG
NACH
LOWRY/PETERSON
39
4.2.8.2
BESTIMMUNG
NACH
KRYSTAL
39
4.2.9
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
41
5
ERGEBNISSE
42
5.1
ZYTOSOLPRAEPARATION
AUS
RATTENLEBER
5.1.1
ORGANEN
TNAH
ME
42
5.1.2
ZYTOSOL-PRAEPARATION
42
5.2
REINIGUNG
DER
PHOSPHOLIPASE
C
45
5.2.1
DEAE-SEPHACEL
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
45
5.2.2
PHOSPHOCELLULOSE-IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
51
5.2.3
ULTROGEL-ACA
34-GELFILTRATION
56
5.2.4
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
AN
MONO
Q
61
5.2.5
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
AN
MONO
S
65
5.2.6
AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE
AN
TSK
G4000SW
+
TSK
G3000SW
67
5.2.7
BILANZIERUNG
71
5.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
PHOSPHOLIPASE
C
73
5.3.1
BEZIEHUNG
DER
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAETSMESSUNG
ZUR
REAKTIONSZEIT
73
5.3.2
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
75
5.3.2.1
HIGH-PERFORMANCE-GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE
75
5.3.2.2
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
75
5.3.2.3
SDS-PAGE
77
5.3.3
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAET
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
PROTEINKONZENTRATION
78
5.3.4
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
PHOSPHOLIPASE
C
78
5.3.5
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-MENTEN-KONSTANTEN
(K
M
-WERT)
UND
DER
MAXIMALEN
REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT
81
5.3.6
EFFEKT
VON
KALZIUM
UND
MAGNESIUMIONEN
AUF
DIE
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAET
83
5.3.7
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
AUF
DIE
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAET
85
3
6
DISKUSSION
87
7
ZUSAMMENFASSUNG
91
8
LITERATURVERZEICHNIS
93
9
DANKSAGUNG
109
10
LEBENSLAUF
110 |
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