Gezielte Konstruktion und Charakterisierung von Mutationen des IacY-Gens für das Studium von Membraninsertion und Transportfunktion der Lactose Permease von Escherichia coli: in-vivo Komplementation zwischen sich ergänzenden Segmenten des Proteins:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
LA.
EINLEITUNG
1
1.1.
GRUNDLEGENDE
INFORMATIONEN
ZUR
LACTOSE
PERMEASE
1
1.2.
MEMBRAN-INSERTION
VON
PROTEINEN
4
2
YY
MATERIAL
IO
2.1.
ABKUERZUNGEN
10
2.2.
CHEMIKALIEN
11
2.3.
ENZYME
11
2.4.
MEDIEN
UND
PLATTEN
12
2.5.
OLIGONUKLEOTIDE
12
2.6.
BAKTERIENSTAEMME
UND
IHRE
EIGENSCHAFTEN
13
2.7.
PLASMIDE
13
2.8.
RADIOAKTIVE
MATERIALIEN
16
2.9.
SONSTIGES
16
3
YY
METHODEN
17
3.1.
MIKROBIOLOGISCHE
ARBEITEN
17
3.1.1.
MIKROBIOLOGISCHE
KONTRO
11
VERSUCHE
17
3.1.2.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
17
3.1.3.
PRAEPARATION
VON
E.COLI
-
MINIZELLEN
18
3.2.
PRAEPARATION
CYTOPLASMATISCHER
MEMBRANEN
19
3.3.
IN-VIVO
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTI
VITAET
19
3.4.
ARBEITEN
MIT
PLASMID-DNA
22
3.4.1.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIENZELLEN
22
3.4.2.
DNA-ISOLIERUNG
AUS
GELEN
22
3.4.3.
ENZYMKATALYSIERTE
DNA-REAKTIONEN
23
3.4.3.1.
BAL-31-VERDAU
23
3.4.3.2.
PCR-MUTAGENES
E
23
3.4.3.3.
DNA-SEQUEN
Z
I
ERUNG
24
3.4.3.4.
SONSTIGE
REAKTIONEN
25
3.4.4.
PLASMIDKONSTRUKTION
25
3.4.5.
RETR
ANS
F
ORMAT
I
ONEN
27
3.5.
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
27
3.5.1.
MARKIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
27
3.5.1.1.
STABILITAETSBESTIMMUNG
VON
NEU
SYNTHETISIERTEN
PROTEINEN
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
DURCH
"PULSE
CHASE"
-
MARKIERUNG
28
3.5.1.2.
LOKALISIERUNG
MARKIERTER
PROTEINE
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
DURCH
AUFSCHLUSS
UND
FRAKTIONIERUNG
29
3.5.2.
SUBSTRATSCHUTZ
GEGEN
ETHYLIERUNG
DURCH
NEM
29
3.5.3.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
MIT
DEM
C-TERMINUS
DER
LACTOSE
PERMEASE
30
3.5.4.
LOWRY-PROTEINBESTIMMUNG
31
3.6.
GELELEKTROPHORESEN
31
3.6.1.
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
31
3.6.2.
AUFTRENNUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
31
3.6.3.
SEQUENZGELE
32
3.6.4.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
32
4.
ERGEBNISSE
34
4.1.
KURZE
EINFUEHRUNG
DER
KONSTRUIERTEN
LACY
-
ALLELE
UND
IHRER
BENENNUNG
34
4.2.
KOMBINATION
DES
LACY
-
DELETIONSGENS
*Y4-69
MIT
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y71/1
UND
Y143
37
4.2.1.
KONSTRUKTION
38
4.2.2.
ERGEBNIS
DER
ANALYSE
DER
KOMPLEMENTATIONSBE
DINGTEN
FAEHIGKEIT
ZUR
LACTOSEAUFNAHME
39
4.2.3.
KONTROLLVERSUCHE
46
4.2.4.
ANALYSE
DER
VON
PAY
UND
PBY
CODIERTEN
LACY
PROTEINE
47
4.2.4.1.
SUBSTRATSCHUTZ
DES
DELETIONSPROTEINS
*Y4-69
VOR
MARKIERUNG
DURCH
NEM
UNTER
KOMPLEMENTIERENDEN
BEDINGUNGEN
47
4.2.4.2.
MARKIERUNG
DES
DELETIONSPROTEINS
*Y4-69
DURCH
EINEN
GEGEN
DEN
C-TERMINUS
GERICHTETEN
ANTI
KOERPER
UNTER
KOMPLEMENTIERENDEN
BEDINGUNGEN
48
4.2.4.3.
DARSTELLUNG
DER
VON
PBY
CODIERTEN
PROTEINE
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
50
4.3.
KOMBINATION
DES
LACY
-
DELETIONSGENS
*Y4-69
MIT
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y71/1.Y174
51
4.3.1.
KONSTRUKTION
52
4.3.2.
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTIVITAET
56
4.3.3.
PROTEINDARSTELLUNG
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
58
4.4.
KOMBINATION
DER
LACY
-
DELETIONSGENE
*Y4-114.
60
*Y4-142
MIT
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y115/4.
.
.Y174
4.4.1.
KONSTRUKTION
60
4.4.2.
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTIVITAET
63
4.4.3.
PROTEINDARSTELLUNG
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
63
4.5.
KOMBINATION
DER
LACY
-
DELETIONSGENE
*Y4-45
UND
*Y4-98
MIT
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y5O.Y174
65
4.5.1.
KONSTRUKTION
65
4.5.2.
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTIVITAET
68
4.5.3.
PROTEINDARSTELLUNG
IN
E.COLI
~
MINIZELLEN
70
4.6.
KOMBINATIONEN
DER
LACY
-
DELETIONSGENE
73
*Y72-114
.
*Y72-142
MIT
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y7O-115/4.
.Y70-143
UND
DEN
LACY
-
ABBRUCHGENEN
Y115/4.
.
.Y174
4.6.1.
KONSTRUKTION
73
4.6.2.
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTIVITAET
75
4.6.3.
PROTEINDARSTELLUNG
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
78
4.7.
KONSTRUKTION
UND
ANALYSE
VON
PERMEASE-VARIANTEN
MIT
HELIXVERDOPPLUNG,
HELIXAUSTAUSCHEN
ODER
LINKER-INSERTIONEN
IM
N-TERMINALEN
BEREICH
81
4.7.1.
KONSTRUKTION
82
4.7.2.
BESTIMMUNG
DER
LACTOSE-TRANSPORTAKTIVITAET
86
4.7.3.
PROTEINDARSTELLUNG
IN
E.COLI
-
MINIZELLEN
88
DISKUSSION
91
FIJ,
GUSAMMENFASGUNG
II4
118
LITERATURVERZEICHNIS
120 |
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