Direkter Gentransfer in Protoplasten der Sonnenblume (Helianthus annuus L.) mittels Elektroporation oder PEG:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG SEITE
L. L HERKUNFT UND BEDEUTUNG
DER SONNENBLUME 1
1.2 ZUECHTUNG UND BEDEUTUNG
BIOTECHNOLOGISCHER VERFAHREN 2
1.3 TRANSFORMATION HOEHERER PFLANZEN 3
1.4 GRUNDLAGEN DER ELEKTROPORATION 4
1.5 ZIEL DER ARBEIT 7
2.
MATERIAL UND METHODEN
2.1. PFLANZENANZUCHT 9
2.1.1 HERKUNFT DES MATERIALS 9
2.1.2 OBERFLAECHENSTERILISATION
DER ACHAENEN 9
2.1.3 STERILE ANZUCHT DER PFLANZEN 9
2.2. ISOLATION VON PROTOPLASTEN 10
2.2.1 ENZYMATISCHER VERDAU VON BLAETTERN,
PETIOLEN UND HYPOCOTYLSEGMENTEN 10
2.2.2 REINIGUNG DER PROTOPLASTEN 11
2.2.3 VITALITAETSTEST DURCH FDA-FAERBUNG 11
2.3. KULTUR IMMOBILISIERTER
* PROTOPLASTEN 13
2.3.1 EINBETTUNG UND KULTUR IN
AGAROSETROPFEN 13
2.3.2 KULTIVIERUNG VON PROTOPLASTENKALLI 13
2.3.3 SELEKTION KANAMYCIN-RESISTENTER
KALLI 14
2.4. DNA-ISOLATION 14
2.4.1 ANZUCHT DER BAKTERIENSTAEMME 14
2.4.2 ISOLATION VON PLASMID-DNA DURCH
ALKALISCHE LYSE 17
2.4.3 ISOLATION VON PLASMID-DNA NACH
DER TRITON-X-100-METHODE 18
2.4.4 REINIGUNG VON PLASMID-DNA DURCH
CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTEN 19
2.4.5 ISOLATION VON PLASMID-DNA DURCH
IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN 20
2.4.6 ISOLATION CHROMOSOMALER DNA 21
2.4.7 DNA-QUANTIFIZIERUNG 23
2.4.8 RESTRIKTIONSSPALTUNG 24
2.4.9 GELELEKTROPHORESE 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/940887819
SEITE
2.5. DIREKTER PLASMID-TRANSFER
IN PROTOPLASTEN 25
2.5.1 ELEKTROPORATION IM
MIKROSEKUNDEN-BEREICH 25
2.5.2 ELEKTROPORATION IM
MILLISEKUNDEN-BEREICH 27
2.5.3 PEG-METHODE 2 8
2.6 AUFNAHME DES VITALFARBSTOFFS
EVANS BLUE IN MESOPHYLLPROTOPLAS
TEN NACH ELEKTROPORATION 29
2.7. DETEKTION DER SS-GIUKURONIDASE-
AKTIVITAET 30
2.7.1 FLUORIMETRISCHE GUS-MESSUNG
AN PROTOPLASTEN 30
2.7.2 INHIBIERUNG DER GENEXPRESSION 31
2.7.3 CYTOCHEMISCHE GUS-FAERBUNGEN 32
2.7.4 PROTEINBESTIMMUNG 3 3
2.8. SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG 34
2.8.1 ISOLATION VON DNA-BANDEN AUS AGA-
ROSEGELEN MITTELS GLASMILCH (QIAEX) 34
2.8.2 DIGOXIGENINMARKIERUNG 35
2.8.3 NEUTRALE SOUTHERNBLOTS 37
2.8.4 HYBRIDISIERUNG 37
2.8.5 IMMUNDETEKTION GEBUNDENER SONDE 39
3.
ERGEBNISSE
3.1 PFLANZENANZUCHT 41
3.2 PROTOPLASTENISOLATION 41
3.3. AGAROSETROPFENKULTUR 45
3.3.1 EINBETTUNGSDICHTE 45
3.3.2 SONSTIGE KULTURBEDINGUNGEN 46
3.4. DNA-ISOLATION 48
3.4.1 ISOLATION VON PLASMID-DNA 48
3.4.2 ISOLATION CHROMOSOMALER DNA 51
3.5. BESTIMMUNG DER SS-GLUKURONIDASE-
AKTIVITAET IN PROTOPLASTEN 52
3.5.1 FLUORIMETRISCHE GLUKURONIDASE-
MESSUNG 52
3.5.2 CYTOCHEMISCHE FAERBUNG 56
SEITE
3.6
3.6.1
3.6.2
KINETIK DER TRANSIENTEN EXPRESSION 57
GUS-EXPRESSION OHNE HEMMSTOFFE 57
HEMMUNG VON TRANSKRIPTION
UND TRANSLATION 58
3.7.
3.7.1
3.7.2.
3.7.2.1
3.7.2.2
3.7.2.3
3.7.2.3.1
3.7.2.3.2
3.7.2.4
ELEKTROPORATION IM MIKRO
SEKUNDENBEREICH
AUFNAHME DES FARBSTOFFS EVANS BLUE
IN ELEKTROPORIERTE MESOPHYLL
PROTOPLASTEN
TRANSFEKTION MIT PLASMID-DNA
OPTIMIERUNG DER PULSPARAMETER
BEI MPS
OPTIMIERUNG DER PULSPARAMETER
BEI PPS
ZUSAMMENSETZUNG DES PULSMEDIUMS
IONEN-ZUSAMMENSETZUNG
RADIKA1-SKAVENGER
BEDEUTUNG VON TEMPERATUR, RESEAL-
BEDINGUNGEN UND HITZESCHOCK
60
60
64
64
67
70
70
73
74
3.8.
3.8.1
3.8.2
3.8.3
PLASMID-TRANSFER DURCH BEHANDLUNG
MIT PEG 76
ROLLE DER PEG-KONZENTRATION 76
HITZE-VORBEHANDLUNG 78
ROLLE DIVALENTER KATIONEN 78
3.9.
3.9.1
3.9.2
ELEKTROPORATION IM MILLI-
SEKUNDENBEREICH
OPTIMIERUNG DER PULSDAUER
WIRKUNG DER FELDSTAERKE
3.10
ELEKTROPORATION IN GEGENWART
VON PEG
79
79
82
83
3.11
EINFLUSS DER DNA-KONFORMATION 84
3.12.
3.12.1
3.12.2
3.13.
3.13.1
3.13.2
DIREKTER VERGLEICH DER TRANSFEK-
TIONSMETHODEN 85
GUS-EXPRESSION UND UEBERLEBENSRATEN 85
REGENERATIONSFAEHIGKEIT DER
PROTOPLASTEN 9 0
SCREENING AUF MARKERGENE EXPRE
MIERENDE KALLI 92
KANAMYCIN-SENSITIVITAET VON PROTO
PLASTEN UND MIKROKALLI 92
KANAMYCIN-SELEKTION NACH BEHAND
LUNG MIT PRT 103 NEO 97
SEITE
3.13.3
3.13.3.1
3.13.3.2
3.13.4
HYBRIDISIERUNG MIT DER
NPT II- SONDE
SOUTHERN-BLOTS GESPALTENER
KALLUS-DNA
DOPPELSPALTUNG MIT SPH I
UND HIND III
HISTOCHEMISCHE GLUKURONIDASE-
FAERBUNGEN AN GUS-TRANSFIZIERTEN
PROTOPLASTENKALLI
106
106
109
110
4.
4.1
4.2.
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.3
4.4
4.5
4.6
DISKUSSION
FARBSTOFF-KINETIKEN UND GUS-
EXPRESSION
ELEKTROPORATION
MEDIEN
TEMPERATUR, RESEALBEDINGUNGEN UND
HITZ E-VORBEHANDLUNG
PULSPARAMETER
ELEKTROPORATION IN GEGENWART
VON PEG
PEG VERMITTELTER DNA-TRANSFER
REGENERATION MARKERGENE EXPRE-
MIERENDER KALLI
BEDEUTUNG VON GEWEBE UND GENOTYP
AUSBLICK
113
114
115
119
120
125
126
127
129
131
ZUSAMM
ENFASSUNG
133
LITERATUR
136 |
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