Untersuchungen zur Cardenolidbiosynthese an photomixotrophen Sprosskulturen von Digitalis purpurea L.: Nachweis, Charakterisierung und Isolierung spezifischer Enzymaktivitäten
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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INHALTSVERZEICHNIS
:
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
CARDENOLIDGLYKOSIDE
.
1
1.1.1
VORKOMMEN
DER
CARDENOLIDE
.
1
1.1.2
STRUKTURMERKMALE
DER
CARDENOLIDE
.
2
1.1.3
MEDIZINISCHE
ANWENDUNG
VON
CARDENOLIDEN
.
3
1.2
BIOSYNTHESE
DER
CARDENOLIDE
.
5
1.3
REGULATION
DER
CARDENOLIDKONZENTRATION
RESPEKTIVE
DER
BIOSYNTHESE
.
9
1.3.1
ORGANKULTUREN
.
9
1.3.2
MEDIEN
VARIATIONEN
.
12
1.4
ZIELE
DER
ARBEIT
.
16
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
17
2.1
ETABLIERUNG
EINER
PHOTOMIXOTROPHEN
SPROSSKULTUR
AUS
SAMEN
VON
DIGITALIS
PURPUREA
.
17
2.1.1
KULTURBEDINGUNGEN
.
17
2.1.2
MEDIEN
DER
DIGIRAFIS-SPROSSKULTUR
.
17
2.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
SPROSSKULTUR
VON
DIGITALIS
PURPUREA
.
18
2.2.1
FRISCHGEWICHT,
TROCKENGEWICHT
UND
WASSERGEHALT
.
18
2.2.2
NITRATGEHALT
DES
NAEHRMEDIUMS
.
18
2.2.3
GLUCOSEGEHALT
DES
NAHRMEDIUMS
.
19
2.2.4
CHLOROPHYLLGEHALT
DER
BLAETTERN
.
19
2.2.5
BESTIMMUNG
DES
LOESLICHEN
UND
DES
MIKROSOMAL
GEBUNDENEN
PRO
TEINANTEILS
.
19
2.3
ANALYSE
DER
CARDENOLIDGENINZUSAMMENSETZUNG
.
19
2.3.1
ISOLIERUNG
DER
CARDENOLIDGLYKOSIDE
.
19
2.3.2
HYDROLYSE
DER
ZUCKERKETTE
MIT
TFA
.
20
2.3.3
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
AGLYKONZUSAMMENSET
ZUNG
DURCH
HPLC
.
20
2.4
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
PREGNANE
.
21
2.4.1
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
.
21
2.4.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
PREGNANE
.
21
2.4.3
QUANTIFIZIERUNG
DER
PREGNANE
.
21
2.5
ENZYMPRAEPARATION
FUER
DIE
DETERMINATION
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
AKTIVITAET
.
22
2.5.1
HERSTELLUNG
DES
ENZYMROHHOMOGENATES
.
22
2.5.2
ENZYMTEST
FUER
DIE
BESTIMMUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
AKTIVITAET
.
22
2.5.3
EXTRAKTION
UND
REINIGUNG
DER
PREGNANE
.
23
2.6
ENZYMTEST
FUER
DIE
BESTIMMUNG
DER
PROGESTERON
5A-REDUKTASE
AKTIVITAET
.
.
24
2.7
ENZYMPRAEPARATION
FUER
DIE
BESTIMMUNG
DER
3SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDO
REDUKTASE
UND
DER
3A-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
AKTIVITAET
.
24
2.7.1
HERSTELLUNG
DES
ENZYMROHHOMOGENATES
.
25
2.7.2
ENZYMTEST
FUER
DIE
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
VON
3SS-HYDROX
YSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
UND
3A-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDO
REDUKTASE
.
25
2.8
ISOLIERUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
25
2.8.1
DEAE-SEPHACEL
LONENAUSTAUSCHCHROMATOROPHIE
.
25
2.8.1.1
ANALYSE
DER
SAEULENFRAKTIONEN
.
26
2.8.2
KONZENTRIERUNG
DER
AKTIVEN
SAEULENFRAKTIONEN
.
26
2.8.3
BLUE-SEPHAROSE
C1-6B
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
26
2.8.4
KONZENTRIERUNG
UND
ENTSALZUNG
DER
AKTIVEN
FRAKTIONEN
.
26
2.8.5
2
'
,
5
'
ADP-SEPHAROSE
4B
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
27
2.8.6
ELUTION
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
NACH
EINER
NICHT-DISSOZIIE
RENDE
PAGE
.
27
2.8.7
BESTIMMUNG
DER
MOLMASSE
DER
NATIVEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTA
SE
.
28
2.8.7.1
EICHUNG
DER
GELFILTRATIONSSAEULE
.
28
2.8.7.2
GELFILTRATION
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
28
2.9
ELEKTROPHORETISCHE
REINHEITSBESTIMMUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
.
29
2.9.1
PROBENVORBEREITUNG
.
29
2.9.2
SDS-PAGE
.
29
2.9.3
VISUALISIERUNG
DER
PROTEINE
IM
SDS-GEL
DURCH
SILBERFARBUNG
.
29
2.10
PROTEINSEQUENZIERUNG
DER
GEREINIGTEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
30
2.10.1
PARTIELLE
PROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTA
SE
.
30
2.10.2
PARTIELLE
PROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
WAEHREND
EINER
SDS-PAGE
.
30
2.10.3
SEMI-DRY
WESTEMBLOTTING
AUF
EINE
PVDF-MEMBRAN
.
31
2.10.4
PROTEINFAERBUNG
NACH
DEM
TRANSFER
AUF
EINE
PVDF-MEMBRA
NEN
.
31
2.10.5
PROTEINSEQUENZIERUNG
.
32
2.11.
METHODEN
DER
NUKLEINSAEUREANALYTIK
.
32
2.11.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
32
2.11.2
ELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
33
2.11.2.1
DENATURIERENDES
AGAROSEGEL
MIT
FORMALDEHYD
.
33
2.11.2.2
DENATURIERENDES,
ALKALISCHES
AGAROSE-GEL
.
33
2.11.2.3
NICHT-DENATURIERENDES
AGAROSE
GEL
.
34
2.11.3.
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
.
34
2.11.3.1
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
NACH
DER
PHENOL-METHO
DE
.
34
2.11.3.2
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
MIT
QIAGEN-SAEULEN
.
35
2.11.4
ISOLIERUNG
DER
MRNA
.
36
2.11.5
NICHT-RADIOAKTIVE
DIGITOXIGENIN
MARKIERUNG
VON
DNA-PRO
BEN
.
36
2.11.6
NORTHEM-BLOTTING
.
37
2.11.7
VISUALISIERUNG
DER
RNA
NACH
NORTHEM-BLOTTING
.
38
2.11.8
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
UND
DETEKTION
DURCH
CHEMILUMI
NESZENZ
.
38
2.12
HERSTELLUNG
DER
DIGITALIS
PURPUREA
CDNA-BANK
.
39
2.12.1
SYNTHESE
DES
ERSTEN
STRANGS
.
41
2.12.2
SYNTHESE
DES
ZWEITEN
STRANGS
.
41
2.12.3
"BHMTING
"
DER
CDNA
ENDEN
UND
LIGATION
DER
ECORI-ADAPTER
.
42
2.12.4
PHOSPHORYLIERUNG
DER
ECORI
ENDEN
UND
XHOL
VERDAU
.
42
2.12.5
GELFILTRATION
MIT
SEPHACRYL
S-400
.
43
2.12.6
LIGATION
DER
CDNA
IN
DEN
VEKTOR
.
43
2.12.7
VERPACKUNG
DER
CDNA
IN
DEN
LAMBDA
PHAGEN
.
43
2.12.8
ANZUCHT
DER
BAKTERIENSTAEMME
.
44
2.12.9
TITERBESTIMMUNG
DER
LIGATIONSANSAETZE
UND
DER
CDNA
BANK
.
44
2.12.10
AMPLIFIKATION
DER
CDNA
BANK
.
45
2.13
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
45
3.
ERGEBNISSE
.
47
3.1
DIE
PHOTOMIXOTROPHE
SPROSSKULTUR
VON
DIGITALIS
PURPUREA
.
47
3.1.1
ETABLIERUNG
DER
SPROSSKULTUR
AUS
SAMEN
VON
DIGITALIS
PURPUREA
.
47
3.1.2
KULTURCHARAKTERISIERUNG
.
47
3.1.2.1
PARAMETER
DES
WACHSTUMS:
FRISCHGEWICHT,
TROCKENGE
WICHT
UND
WASSERGEHALT
.
47
3.1.2.2
PARAMETER
DES
MEDIUMS:
GLUCOSEGEHALT,
NITRATGEHALT
UND
PH-WERT
.
49
3.1.2.3
CHLOROPHYLLGEHALT
.
49
3.1.2.4
PROTEINGEHALT
.
49
3.1.2.5
MODIFIKATIONEN
DES
NAEHRSTOFFANGEBOTES
.
50
3.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
PREGNANE
.
54
3.3
IDENTIFIZIERUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
CARDENOLIDAGLYKONE
.
55
3.4
CHARAKTERISIERUNG
VON
3SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
(E.C.1.1.1.
51)
UND
3A-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
(E.C.1.1.1.50)
.
57
3.4.1
LOKALISATION
.
58
3.4.2
PROTEINABHAENGIGKEIT
.
59
3.4.3
KURZZEITKINETIK
.
59
3.4.4
PH-ABHAENGIGKEIT
.
60
3.4.5
TEMPERATURABHAENGIGKEIT
.
61
3.4.6
EINFLUSS
VON
MONO
UND
BIVALENTEN
KATIONEN
.
62
3.4.7
BEREITSTELLUNG
VON
REDOXEQUIVALENTEN
.
64
3.4.8
ABHAENGIGKEIT
DER
ENZYMAKTIVITAET
VOM
PREGNAN-SUBSTRAT
.
71
3.4.8.1
REDUKTIONSAKTIVITAET
DER
3SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDORE
DUKTASE
UND
3A-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
VON
5SS-PREGNAN-3,20-DION
.
71
3.4.8.2
ABHAENGIGKEIT
DER
OXIDATIONSAKTIVITAET
DER
3SS-HYDROXY
STEROID
5SS-OXIDOREDUKTASE
UND
3A-HYDROXYSTEROID-5SS
OXIDOREDUKTASE
.
75
3.4.9
STABILITAET
DER
3A/SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
AKTIVITAET
.
75
3.5
KULTURALTERABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAETEN
VON
PROGESTERON
5A-REDUKTASE,
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE,
3SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
UND
DES
CARDENOLIDGEHALTES
.
76
3.5.1
AKTIVITAETSUNTERSCHIEDE
VON
PROGESTERON
5A-REDUKTASE
UND
PROGE
STERON
5SS-REDUKTASE
IN
BEZUG
AUF
DIE
KULTIVIERUNG
IN
DIVER
GENTEN
MEDIEN
.
78
3.6
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
79
3.6.1
DEAE-SEPHACEL
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
80
3.6.2
KONZENTRIERUNG
DER
PROBEN
.
81
3.6.3
BLUE-SEPHAROSE
C1-6B
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
81
3.6.4
2
'
.5
'
-ADP-SEPHAROSE
4B
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
83
3.6.5
ISOLIERUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
NACH
EINER
DISKONTINU
IERLICHEN
NICHT-DISSOZIIERENDEN
PAGE
.
84
3.6.6
REINHEITSBESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
DURCH
SDS-PAGE
.
85
3.6.7
BESTIMMUNG
DER
MOLMASSE
DER
AKTIVEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTA
SE
.
87
3.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
89
3.7.1
ABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAET
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
VON
REDUKTIONSEQUIVALENTEN
.
89
3.7.2
ABHAENGIGKEIT
DER
AKTIVITAET
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
VOM
SUBSTRAT
UND
BESTIMMUNG
DES
KYY-WERTES
.
91
3.7.3
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
GEREINIGTEN
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
92
3.7.4
STABILITAET
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
93
3.8
PEPTIDSEQUENZIERUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
93
3.9
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
94
3.9.1
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
.
94
3.9.2
ISOLIERUNG
DER
MRNA
.
96
3.10
NORTHERN-HYBRIDISIERUNG
.
96
3.11
SYNTHESE
DER
CDNA-BANK
VON
DIGITALISPURPUREA
.
97
4.
DISKUSSION
.
100
4.1
DIE
PHOTOMIXOTROPHE
SPROSSKULTUR
VON
DIGITALIS
PURPUREA
.
100
4.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
AKTIVITAETEN
VON
3SS-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUK
TASE
UND
3A-HYDROXYSTEROID-5SS-OXIDOREDUKTASE
.
101
4.3
ABHAENGIGKEIT
DES
CARDENOLIDGEHALTES,
DER
SPEZIFISCHEN
ENZYMAKTIVITAETEN
DER
BIOSYNTHESE
UND
DER
PROGESTERON
5A-REDUKTASE
VOM
KULTURALTER
.
.
109
4.4
VERGLEICH
DER
ENZYME
DER
CARDENOLIDBIOSYNTHESE
UND
IHRER
REGULATORI
SCHEN
FUNKTIONEN
.
HO
4.5
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROGESTERON
5SS-REDUKTASE
.
112
4.6
VERGLEICH
TIERISCHER
UND
PFLANZLICHER
A
4
-KETOSTEROID-REDUKTASEN
UND
IHRE
REGULATION
.
116
4.7
NUKLEINSAEUREANALYTIK
UND
AUSBLICK
.
118
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
121
6.
L
I
T
E
R
A
T
U
R
.
123 |
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