Untersuchungen zu Wachstum und Zielfindung retinaler Axone des Huhns:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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INHALT
ABKUERZUNGEN
I.
EINLEITUNG
.
1
II.
MATERIAL
.
10
LLL.
METHODEN
.
19
1.
ZELL-
UND
BAKTERIENKULTUR
.
19
1.1
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
.
19
1.1.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
19
1.1.2
T
RANSFORMATION
.
19
1.1.3
KULTIVIERUNG
AUF
AGARPLATTEN
.20
1.1.4
FLUESSIGKULTUR
.
20
1.1.4.1
UEBEMACHTKULTUR
.20
1.1.4.2
GROSSE
FLUESSIGKULTUR
.
21
1.1.5
GLYZERIN-DAUERKULTUR
.
21
1.2.
ARBEITEN
MIT
COS-ZELLEN
.
21
1.2.1.
COS-ZELLKULTIVIERUNG
.
21
1.2.1.1
BEGINN
DER
KULTIVIERUNG
AUS
IN
FLUESSIGSTICKSTOFF
AUFBEWAHRTEN
VORRATSZELLEN
.
21
1.2.1.2
SUBKULTIVIERUNG
VON
COS-ZELLEN
.
22
1.2.1.3
EINFRIEREN
VON
COS-ZELLEN
.22
1.2.2
TRANSFEKTION
VON
COS-ZELLEN
.
23
1.2.2.1
TRANSFEKTION
NACH
DER
DEAE-DEXTRAN
METHODE
.
23
1.2.2.2.
TRANSFEKTION
DURCH
ELEKTROPORATION
.24
1.2.3
X-GAL
FAERBUNG
PCDM8SS1
-TRANSFIZIERTER
COS-ZELLEN
.
25
1.2.4
3G8-LMMUNOFLUORESZENZFAERBUNG
PCEXV(FC7RIII-L)TRANS
FIZIERTER
COS-ZELLEN
.
26
1.3
FUNKTIONELLE
ASSAYS
.27
1.3.1
PRAEPARATION
VON
COS
UND
TEKTUMZELLMEMBRANEN
.
27
1.3.1.1
SUCROSEGRADIENT-MEMBRANPRAEPARATION
.
27
1.3.1.2
HAMSTOFF-MEMBRANPRAEPARATION
.28
1.3.1.3
SOLUBILISIERUNG
UND
REKONSTITUTION
VON
HAMSTOFFVESIKELN
.
29
1.3.1.4
INKUBATIONEN
VON
MEMBRANVESIKELN
MIT
LEKTINEN
BZW.
ENZYMEN
.
30
1.3.2
HERSTELLUNG
VON
RETINAEXPLANTATEN
.
32
1.3.3
ENTSCHEIDUNGSTEST
(STREIFENTEST)
.
.33
1.3.3.1
HERSTELLUNG
DER
MEMBRANTEPPICHE
.33
1.3.3.2
HERSTELLUNG
DER
KULTUREN
FUER
DEN
ENTSCHEIDUNGSTEST
.
34
1.3.3.3 AUSWERTUNG
DES
ENTSCHEIDUNGSTESTS
.
34
1.3.4
KOLLAPSTEST
.
.
35
1.3.4.1
RETINAKULTUREN
.
35
1.3.4.1
DURCHFUEHRUNG
DES
KOLLAPSTESTS
.
35
2.
ARBEITEN
MIT
NUKLEINSAEUREN
.
.
36
2.1
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
.
36
2.1.1
SCHNEIDEN
MIT
DEN
RESTRIKTIONSENZYMEN
ECORI
UND
PST
I
.36
2.1.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
.37
2.1.3
LIGATION
.
37
2.1.4
NICK-TRANSLATION
VON
DNS
.
38
2.2.
NUKLEINSAEURE-AUFREINIGUNG
.
39
2.2.1
PHENOL/CHLOROFORM
/
DIETHYLETHER
-
EXTRAKTION
.
39
2.2.2
ETHANOLPRAEZIPITATION
.40
2.2.3
PRAEPARATIVE
NICHTDENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
40
2.2.4
ELEKTROELUTION
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
.
41
2.2.5
GELFILTRATION
ZUR
TRENNUNG
VON
DNS
UND
MONONUKLEOTIDEN
.
43
2.2.6
BESEITIGUNG
VON
DNS-VERUNREINIGUNGEN
AUS
RNS-PRAEPARATIONEN
VON
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.43
2.2.7
MINIPRAEPARATIONEN
VON
DNS
.
44
2.2.7.1
ALKALISCHE
LYSE
/
CTAB-FAELLUNG
.
44
2.2.7.2
KOCHLYSE
/
CTAB-FAELLUNG
.46
2.2.8
MAXIPRAEPARATION
VON
DNS
.
.47
2.2.8.1
ALKALISCHE
LYSE
/
CSCI-GRADIENT
.
47
2.2.8.2
QUIAGEN-IONENAUSTAUSCHERSAEULE
.
48
2.2.9
PRAEPARATION
VON
RNS
.
.50
2.2.9.1
GRUNDLEGENDE
VORSICHTSMASSNAHMEN
BEI
DER
ARBEIT
MIT
RNS
.
50
2.2.9.2
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNS
AUS
COS
ZELLEN
.50
2.3
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
52
2.3.1
ANALYTISCHE
NICHTDENATURIERENDE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.52
2.3.2
GLYOXAL-GELELEKTROPHORESE
VON
RNS
.52
2.3.3
NORTHERN
T
RANSFER
.
54
2.3.4
HYBRIDISIERUNG
MIT
DOPPELSTRAENGIGEN
DNS-SONDEN
.
54
2.3.5
AUTORADIOGRAPHIE
.
56
2.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
56
2.4.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
DURCH
DIE
BESTIMMUNG
DER
OD
260/280
.
56
2.4.2
CERENKOV-MESSUNG
[
32
P]-MARKIERTER
DNS
.56
2.4.3
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)-FAELLUNG
[
32
P]-MARKIERTER
DNS
ZUR
BESTIMMUNG
DER
EINBAURATE
VON
[
32
P]
.
56
3.
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
57
3.1
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
57
3.2
WESTERN
BLOTTING
AUF
NITROZELLULOSE-MEMBRANEN
.
59
3.3
FAERBEMETHODEN
FUER
BLOTS
.60
3.4
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
.
62
3.4.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
DIE
MESSUNG
DER
OD220
.
62
3.4.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
NACH
EINER
MODIFIZIERTEN
BRADFORD
METHODE
.
62
3.4.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
NACH
DER
BCA-METHODE
.
63
4.
SUBKLONIERUNG
DER
CDNS
AUS
KLON
#10
IN
DEN
EXPRESSIONS
VEKTOR
PCEXV-1
.
.64
4.1
PRAEPARATION
DES
CDNS-LNSERTS
AUS
KLON
#10
.64
4.2
PRAEPARATION
DES
VEKTORS
PCEXV-1
.65
4.3
LIGATION
.
.66
IV.
ERGEBNISSE
.
67
1.
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
CDNS
AUS
KLON
#10
.
67
1.1
ETABLIERUNG
DER
TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN
.
.68
1.1.1
DEAE-DEXTRAN-METHODE
.
68
1.1.2
ELEKTROPORATION
.
68
1.2
EXPRESSION
DES
FCY-REZEPTORS
111-1
.
.68
1.3
SUBKLONIERUNG
DER
CDNS
AUS
KLON
#10
IN
DEN
VEKTOR
PCEXV-1
.69
1.4
KONTROLLE
DER
EXPRESSION
DER
MRNS
VON
PCEXV(10R)
UND
PCEXV(10W)
.
70
1.5
FUNKTIONELLER
TEST
DER
COS-ZELLMEMBRANEN
.
71
1.5.1
KOLLAPSTEST
.
71
1.5.1.1
EIGENSCHAFTEN
VON
ZELLMEMBRANEN
UNTRANSFIZIERTER
COS-ZELLEN
IM
KOLLAPSTEST
.
71
1.5.1.2
EIGENSCHAFTEN
VON
ZELLMEMBRANEN
PCEXV(
1
0R)
UND
PCEXV(
1
0W)
TRANSFIZIERTER
COS-ZELLEN
IM
KOLLAPSTEST
.
.72
1.5.2
ENTSCHEIDUNGSTEST
.
.73
1.5.2.1
EIGENSCHAFTEN
VON
ZELLMEMBRANEN
UNTRANSFIZIERTER
COS-ZELLEN
IM
ENTSCHEIDUNGSTEST
.
.73
1.5.2.2
EIGENSCHAFTEN
VON
ZELLMEMBRANEN
PCEXV(
1
0R)
UND
PCEXV(10W)
TRANSFIZIERTER
COS-ZELLEN
IM
ENTSCHEIDUNGSTEST
.
74
1.6
SEQUENZANALYSE
DER
CDNS
VON
KLON
#10
.76
2.
EINFLUSS
VON
GLYKOSTRUKTUREN
AUF
AXONALES
WACHSTUM
UND
AXONALE
LENKUNG
IM
ENTSCHEIDUNGSTEST
.
78
2.1
DEGLYKOSYLIERUNG
TEKTALER
ZELLMEMBRANEN
MIT
HILFE
VON
ENZYMEN
.
79
2.2
MASKIERUNG
VON
GLYKOSTRUKTUREN
MIT
LEKTINEN
.
83
2.2.1
MODIFIKATION
DES
ENTSCHEIDUNGSTESTS
.
.83
2.2.2
MANNOSE-BINDENDE
LEKTINE
.
85
2.2.3
SIALINSAEURE-BINDENDE
LEKTINE
.
88
2.2.4
GALACTOSE-N-ACETYLGALACTOSAMIN-BINDENDE
LEKTINE
.
90
2.2.5
GALACTOSE-BINDENDE
LEKTINE
.
92
2.2.6
N-ACETYLGLUCOSAMIN-BINDENDE
LEKTINE
.93
2.2.7
FUCOSE-BINDENDE
LEKTINE
.
95
2.2.8
N-ACETYLGALACTOSAMIN-BINDENDE
LEKTINE
.96
2.3
VERDRAENGUNGSVERSUCHE
MIT
GLYKOSAMINOGLYKANEN
.97
V.
DISKUSSION
.
101
1.
EXPRESSION
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
33
KD
MOLEKUELS
DES
POSTERIOREN
TEKTUMS
.
101
2.
GLYKOEPITOPE
UND
AXONALE
ZIELFINDUNG
.
104
3.
ABBAU VON
GLYKOSTRUKTUREN
MIT
GLYKOSIDASEN
.
107
4.
MASKIERUNG
VON
GLYKOEPITOPEN
MIT
LEKTINENI
.
108
4.1
AXONALES
WACHSTUM
.
109
4.2
AXONALE
LENKUNG
.
110
5.
VERDRAENGUNGSVERSUCHE MIT
GLYKOSAMINOGLYKANEN
.
112
6.
SCHLUSSFOLGERUNG
.
112
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
.
114
VII.
NUKLEOTIDSEQUENZ
UND
ABGELEITETE
AMINOSAEURE
SEQUENZ
DES
CDNS-INSERTS
VON
KLON
#10
.
116
VIII.
LITERATURVERZEICHNIS
.
120 |
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