Untersuchungen zur Funktion von Xmrk und src während Embryonalentwicklung und Tumorbildung: Expression in transgenen Medaka-Fischen
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1993
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1.
EINLEITUNG
1.1
ONKOGENE
&
PROTO-ONKOGENE
1
1.1
FUNKTION
DER
PROTO-ONKOGENE
BEI
DER
STEUERUNG
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
2
1.2
DIE
MELANOMBILDUNG
BEI
XTPHOPHORUS-FISCHEN:
XMRK
UNDXSRC
6
1.3
DIE
ANALYSE
VON
ONKO
UND
PROTO-ONKOGENEN
IN
TRANSGENEN
TIEREN
10
1.4
FISCHE
ALS
MODELLSYSTEME
DER
VERTEBRATENENTWICKLUNG:
13
DER
MEDAKA
(ORYZIAS
LATIPES)
1.5
AUFGABENSTELLUNG
18
2.
MATERIAL
2.1
FISCHE
21
2.2
BAKTERIEN
21
2.3
EXPRESSIONSVEKTOREN
22
2.3.1
CAT
REPORTERGENKONSTRUKTE
22
2.3.2
SSGAL
REPORTERGENKONSTRUKTE
24
2.3.3
XMRK
EXPRESSIONSVEKTOREN
24
2.3.4
TGFA
EXPRESSIONSVEKTOREN
2.3.5
XSRC
UND
V-SRC
EXPRESSIONSVEKTOREN
2.4
HYBRIDISIERUNGSPROBEN
UND
PCR
PRIMER
2.5
ENZYME
2.6
RADIOCHEMIKALIEN
2.7
SONSTIGE
CHEMIKALIEN
2.8
MEDIEN
UND
PUFFERLOESUNGEN
2.9
ANTISEREN
2.10
GERAETE
3.
METHODEN
3.1
KONSTRUKTION
VON
EXPRESSIONSVEKTOREN
3.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
3.1.1.1
CTAB
MINIPRAEPARATION
3.1.1.2
CAESIUMCHLORID-METHODE
3.1.2
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
3.1.3
AUFFUELLEN
UEBERSTEHENDER
5
'
-
ENDEN
MIT
KLENOW-POLYMERASE
3.1.4
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
3.1.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
3.1.6
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
3.1.7
HERSTELLEN
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
3.1.8
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
LU
M
M
M
M
M
M
M
LA
LA
LA
LA
LU
LU
LU
LU
LU
H
-
0
0
0
0
0
0
3.2
GENTRANSFER
IN
FISCHEMBRYONEN
37
3.2.1
MIKROINJEKTION
VON
PLASMID-DNA
IN
DAS
ZYTOPLASMA
VON
37
ZWEIZELL-EMBRYONEN
3.2.1.1
VORBEREITEN
DER
FISCHEMBRYONEN
37
3.2.1.2
MIKROINJEKTION
37
3.2.1.3
KULTIVIERUNG
DER
INJIZIERTEN
EMBRYONEN
38
3.2.2
MIKROINJEKTION
VON
PLASMID-DNA
IN
DEN
NUKLEUS
39
UNBEFRUCHTETER
OOZYTEN
3.2.2.1
PRAEPARATION
DER
OOZYTEN
39
3.2.2.2
NUKLEAERE
MIKROINJEKTION
41
3.2.2.3
REIFUNG
UND
BEFRUCHTUNG
DER
OOZYTEN
IN-VITRO
UND
41
KULTIVIERUNG
DER
EMBRYONEN
3.3
ANALYSE
DER
DNA
IN
TRANSGENEN
FISCHEN
42
3.3.1
ISOLIERUNG
HOCHMOLEKULARER
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
EMBRYONEN
UND
42
ADULTFISCHEN
3.3.2
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
42
3.3.2.1
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
42
3.3.2.2
KAPILLARTRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
43
3.3.2.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-"RANDOM
PRIMER
LABELLING"
43
3.3.2.4
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
BLOTS
44
3.3.3
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
45
3.4
ANALYSE
DER
GENEXPRESSION
IN
TRANSGENEN
FISCHEN
46
3.4.1
BESTIMMUNG
DER
CAT-AKTIVITAET
46
3.4.2
HISTO
UND
IMMUNHISTOCHEMISCHE
FAERBEVERFAHREN
47
3.4.2.1
FIXIERUNG
VON
EMBRYONEN
UND
ADULTGEWEBEN
47
3.4.2.2
HERSTELLEN
VON
PARAFFINSCHNITTEN
47
3.4.2.3
HERSTELLEN
VON
GEFRIERSCHNITTEN
48
3.4.2.4
HAEMATOXYLIN-EOSIN
(HE)
FAERBUNG
48
3.4.2.5
SAEUREALIZARIN
(SA)
FAERBUNG
49
3.4.2.6
IMMUNFAERBUNG
MIT
PEROXIDASE
GEKOPPELTEN
ZWEITANTIKOERPEM
49
3.4.2.7
IMMUNFAERBUNG
MIT
FLUOREZEIN
MARKIERTEN
ZWEITANTIKOERPEM
50
3.4.2.8
IMMUNFAERBUNG
AN
GESAMTKOERPERPRAEPARATIONEN
50
("WHOLE
MOUNT"
FAERBUNGEN)
3.4.3
BESTIMMUNG
DER
PP60
SRC
KINASEAKTIVITAET
51
4.
ERGEBNISSE
4.1
ANALYSE
DER
ENDOGENEN
MRK
PROTO-ONKOGEN
EXPRESSION
WAEHREND
DER
52
EMBRYONALENTWICKLUNG
DES
MEDAKA-FISCHES
4.2
GENTRANSFER
IN
MEDAKA-EMBRYONEN:
ANALYSE
DER
AKTIVITAET
HOMOLOGER
UND
56
HETEROLOGER
PROMOTOREN
IN-VIVO
4.2.1
ANALYSE
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION
56
4.2.1.1
ZEITPUNKT
DES
BEGINNS
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION
57
4.2.1.2
ANALYSE
DES
RAEUMLICHEN
MUSTERS
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION
58
4.2.2
VERGLEICH
DER
AKTIVITAET
VERSCHIEDENER
HOMOLOGER
UND
HETEROLOGER
60
PROMOTOREN
4.2.2.1
KONSTITUTIV
AKTIVE
PROMOTOREN
60
4.2.2.2
INDUZIERBARE
UND
GEWEBSSPEZIFISCHE
PROMOTOREN
63
4.3
KLONIERUNG
VON
XMRK
UND
SRC
EXPRESSIONSVEKTOREN
65
4.3.1
XMRK
EXPRESSIONSVEKTOREN
65
4.3.2
SRC
EXPRESSIONSVEKTOREN
67
4.4
EKTOPISCHE
EXPRESSION
DES
XMRK
ONKOGENS
WAEHREND
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
68
VON
MEDAKA-FISCHEN
4.4.1
EFFEKTE
IN
DER
FRUEHEMBRYONALEN
ENTWICKLUNG
DES
KONSTITUTIV
69
EXPRIMIERTEN
XMRK
ONKOGENS:
INDUKTION
DOPPELTER
AXIALORGANE
4.4.2
SPAETE
EFFEKTE
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION:
72
INDUKTION
TUMORARTIGER
LAESIONEN
4.4.3
LIGANDENABHAENGIGKEIT
DER
TUMORENTSTEHUNG
77
4.4.4
IMMUNHISTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
HER/XMRK
EXPRESSION
IN
80
INJIZIERTEN
EMBRYONEN
4.5
BILDUNG
VON
TUMOREN
IN
ADULTEN,
TRANSGENEN
FISCHEN
84
4.6
ETABLIERUNG
STABIL
TRANSGENER
LINIEN
DURCH
NUKLEAERE
MIKROINJEKTION:
89
INDUKTION
EINES
AUGENMELANOMS
DURCH
EXPRESSION
DES
XMRK
ONKOGENS
UNTER
DER
KONTROLLE
EINES
PIGMENTZELLSPEZIFISCHEN
PROMOTORS
4.7
ANALYSE
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION
DES
VIRALEN
UND
ZELLULAEREN
SRC
GENS
NACH
95
GENTRANSFER
IN
MEDAKA-EMBRYONEN
5.
DISKUSSION
5.1
ANALYSE
DER
REGULATION
UND
FUNKTION
VON
GENEN
DURCH
EXPRESSION
IN
102
TRANSGENEN
MEDAKA-FISCHEN
5.2
DAS
TUMOR-INDUZIERENDE
POTENTIAL
DES
XMRK
ONKOGENS
105
5.2.1
ENTSTEHUNG
EMBRYONALER
TUMOREN
ALS
"ONE-STEP-TUMORGENESE
L,
105
5.2.2
LIGANDENABHAENGIGKEIT
DER
TUMORENTSTEHUNG
107
5.2.3
TUMORBILDUNG
IN
STABIL
TRANSGENEN
FISCHEN
110
5.3
FUNKTION
DES
XMRK
PROTO-ONKOGENS
IN
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
114
5.3.1
EXPRESSIONSMUSTER
WAEHREND
DER
EMBRYOGENESE
VON
114
MEDAKA-FISCHEN
5.3.2
TERATOGENE
EFFEKTE
DES
EKTOPISCH
EXPRIMIERTEN
XMRK
ONKOGENS
115
5.3.3
DAS
INDUKTIVE
POTENTIAL
DES
XMRK
ONKOGENS
116
5.4
FUNKTION
DES
XSRC
PROTO-ONKOGENS
IN
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
118
5.4.1
EFFEKTE
DER
EKTOPISCHEN
EXPRESSION
VON
VIRALER
UND
ZELLULAERER
FORM
119
DES
SRC
GENS
5.4.2
AKTIVIERUNG
DES
XSRC
PROTO-ONKOGENS
121
5.5
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
123
6.
LITERATUR
126 |
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| title_full | Untersuchungen zur Funktion von Xmrk und src während Embryonalentwicklung und Tumorbildung Expression in transgenen Medaka-Fischen von Christoph Winkler |
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| title_short | Untersuchungen zur Funktion von Xmrk und src während Embryonalentwicklung und Tumorbildung |
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