Die Strukturgene der CO-Dehydrogenase aus Pseudomonas carboxydovorans coxL, coxM und coxS: Identifizierung, Klonierung und heterologe Expression
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
5
2.1
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
5
2.2
NAEHRMEDIEN
10
2.3
ZELLANZUCHT
UND
ZELLERNTE
12
2.4
ZELLAUFSCHLUSS
12
2.5
PROTEINBESTIMMUNG
13
2.6
BESTIMMUNG
DER
CO-DEHYDROGENASE-AKTIVITAET
13
2.7
GENSONDEN
14
2.7.1
OLIGONUKLEOTID-SONDEN
14
2.7.2
HETEROLOGE
CFR-SONDEN
15
2.8
DNA-ISOLIERUNG
16
2.8.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
16
2.8.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
17
2.8.3
ANALYTISCHE
PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
AUS
E.COLI
18
2.8.4
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
E.COLI
18
2.8.5
BESTIMMUNG
DER
REINHEIT
UND
DNA-KONZENTRATION
IN
DNA-LOESUNGEN
19
2.9
ENZYMATISCHE
DNA-BEHANDLUNGEN
20
2.9.1
REINIGUNG
UND
FAELLUNG
DER
DNA
20
2.9.2
RESTRIKTION
20
2.9.3
ENTFERNUNG
ENDSTAENDIGER
PHOSPHATGRUPPEN
21
2.9.4
LIGATION
21
2.9.5
AUFFUELLEN
EINZELSTRAENGIGER
DNA-BEREICHE
21
2.9.6
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
[
32
P]-ATP
22
2.9.7
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIG-DDUTP
22
2.9.8
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
DIG-DUTP
23
2.9.9
SEQUENZIERUNGS-REAKTION
23
2.10
IN
VITRO
VERPACKUNG
VON
DNA
IN
A-PHAGEN
24
2.11
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
IN
BAKTERIEN
24
2.11.1
TRANSDUKTION
VON
ECO//
24
2.11.2
TRANSFORMATION
VON
E
COLI
24
2.12
GELELEKTROPHORESE
MIT
DNA
25
2.12.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
25
2.12.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
26
2.12.3
ELEKTROELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
27
2.13
DNA-HYBRIDISIERUNGEN
28
2.13.1
HERSTELLUNG
VON
UNBLOTS
29
2.13.2
HERSTELLUNG
VON
DOT-BLOTS
29
2.13.3
UEBERTRAGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUF
NYLON-MEMBRANEN
(SOUTHERN-BLOTS)
29
2.13.4
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
[
32
P]-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
30
2.13.5
HYBRIDISIERUNGEN
MIT
DIG-MARKIERTEN
SONDEN
31
2.14
HETEROLOGE
EXPRESSION
PLASMID-KODIERTER
PROTEINE
IN
E.COLI
32
2.14.1
EXPRESSION
IN
MINIZELLEN
32
2.14.2
EXPRESSION
IN
DEM
T7-EXPRESSIONSSYSTEM
34
2.15
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
MIT
PROTEINEN
35
2.16
UEBERTRAGUNG
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
36
2.17
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
37
2.18
GEWINNUNG
UND
REINIGUNG
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
UNTEREINHEITEN
VON
CO-DEHYDROGENASE
38
2.19
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
39
3
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
40
3.1
HOMOLOGIE
UND
LOKALISATION
VON
COX-GENEN
IN
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
40
3.1.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KONSERVIERUNG
UND
LOKALISATION
DER
COX-GENE
IN
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
40
3.1.2
PHYSIKALISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
43
3.2
GENBANK
DER
GENOMISCHEN
DNA
AUS
P.CARBOXVDOVORANS
OM5
46
3.2.1
KONSTRUKTION
EINER
COSMID-GENBANK
46
3.2.2
CHARAKTERISIERUNG
DES
COSMID-KLONS
2-67
48
3.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
COSMID-KLONS
3-21
51
3.2.4
CHARAKTERISIERUNG
DES
COSMID-KLONS
438
53
3.2.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
COSMID-KLONS
147
57
3.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
KLONEN
EINER
PHCG3-GENBANK
5S
3.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
COX-GENEN
AUF
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
DES
PLASMIDES
PHCG3
60
3.4.1
RESTRIKTIONSANALYSE
DER
DELETIONSDERIVATE
A
1
PHCG3
UND
A
2
PHCG3
60
3.4.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
COX-GENEN
AUF
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
DES
PLASMIDS
PHCG3
DURCH
HYBRIDISIERUNG
64
3.5
KLONIERUNG
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
COXS
65
3.6
KLONIERUNG
UND
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
COXL
69
3.7
IDENTIFIZIERUNG
VON
COXM
79
3.8
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DES
N-TERMINALEN
BEREICHES
VON
COXL
MIT
ANDEREN
PROTEINSEQUENZEN
83
3.9
LOKALISIERUNG
VON
COX-GENEN
AUF
DEM
GENOM
VON
P.CARBOXYDOVORANS
OM5
UND
MUTANTEN
89
4
DISKUSSION
92
4.1
DIE
STRUKTURGENE
DER
CO-DEHYDROGENASE
COXM
,
COXS
UND
COXL
AUS
PSEUDOMONAS
CARBOXVDOVORANS
OM5
92
4.2
CO-DEHYDROGENASEN
CARBOXIDOTROPHER
BAKTERIEN
SIND
KONSERVIERT
103
4.3
DIE
STRUKTURGENE
DER
CO-DEHYDROGENASE
SIND
PLASMID
KODIERT
IN
CARBOXIDOTROPHEN
BAKTERIEN
MIT
PLASMIDEN
107
4.3
DIE
CO-DEHYDROGENASE
AUS
P.CARBOXYDOVORANS
OM5
IST
VERWANDT
MIT
XANTHIN-DEHYDROGENASEN
111
5
ZUSAMMENFASSUNG
114
6
LITERATURVERZEICHNIS
120 |
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