Immunzytochemische und -biochemische Untersuchungen monoklonaler Antikörper gegen Zellen der akuten myeloischen Leukämie:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. MATERI ALUNDMETHODEN 10
2.1
MONOKLONALE ANTIKOERPER 10
2.2 ZELLGEWINNUNG 11
2.2.1 REAGENZIEN H
2.2.1.1 FOETALES KAELBERSERUM (FCS) H
2.2.1.2 BALANCED SALT SOLUTION (BSS) 11
2.2.1.3 DULBECO'S MODIFTED EAGLE MEDIUM (DMEM) 11
2.2.1.4 EINFRIERMEDIUM H
2.2.1.5 GRADIENTENMEDIUM FICOLL-HYPAQUE 12
2.2.1.6 GRADIENTENMEDIUM NEUTROPHIL ISOLATION MEDIUM (NIM) 12
2.2.1.7 PHOSPHAT GEPUFFERTE SALZLOESUNG (PBS) 12
2.2.1.8 TRYPANBLAULOESUNG 13
2.2.2 GEWINNUNG VON AML - ZELLEN (AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE-ZELLEN) 13
2.2.3 GEWINNUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN UND GRANULOZYTEN AUS
PERIPHEREN BLUTLEUKOZYTEN (PBL) 14
2.2.4 TUMORZELLINIEN I
5
2.2.5 LEBENDZELLZAHLBESTIMMUNG 16
2.2.6 ZYTOZENTRIFUGENPRAEPARATE 16
2.3 IMMUNFLUORESZENZNACHWEIS VON MEMBRANANTIGENEN VITALER ZELLEN 17
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.3.1 PRINZIP DER METHODE 17
2.3.2 REAGENZIEN 18
2.3.2.1 BIOTINYLIERTES SCHAF-ANTI-MAUS LG 18
23
.2.2 FLUORESCEIN-STREPTAVIDIN 18
2.3.23 EINDECKMITTEL 18
2.3.3 DURCHFUEHRUNG 19
2.3.4 AUSWERTUNG DER ANTIGEN-NACHWEISREAKTION 20
2.4 IMMUNZYTOCHEMISCHER NACHWEIS VON INTRAZELLULAEREN ANTIGENEN 21
2.4.1 PRINZIP DER METHODE 21
2.4.2 REAGENZIEN 22
2.4.2.1 FORMALIN-ACETON-PUFFER 22
2.4.2.2 BLOCKIERUNGSPUFFER 22
2.4.2.3 BIOTINYLIERTES SCHAF-ANTI-MAUS LG 22
2.4.2.4 STREPTAVIDIN ALKALISCHE PHOSPHATASE KOMPLEX 22
2.4.2.5 CHROMOGEN-SUBSTRAT-PUFFER-LOESUNG FUER ALKALISCHE PHOSPHATASE 23
2.4.2.OE EINDECKMITTEL 23
2.4.3 DURCHFUEHRUNG 24
2.4.4 AUSWERTUNG DER ANTIGENNACHWEISREAKTION 25
2.5 SOLUBILISIERUNG VON ZELLPROTEINEN 26
2.5.1 PRINZIP DER METHODE 26
2.5.2 REAGENZIEN 26
2.5.2.1 LYSEPUFFER 26
2.5.3 DURCHFUEHRUNG 27
2.6 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 28
2.6.1 PRINZIP DER METHODE 28
2.6.2 REAGENZIEN 28
2.6.3 DURCHFUEHRUNG 29
2.7 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON ZELLPROTEINEN 30
2.7.1 PRINZIP DER METHODE 30
2.7.2 REAGENZIEN 30
2.7.2.1 METHIONIN FREIES MEDIUM 30
2.122
L-35S-METHIONIN 30
2.7.3 DURCHFUEHRUNG 31
2.7.4 AUSWERTUNG 31
2.8 IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN 32
2.8.1 PRINZIP DER METHODE 32
2.8.2 REAGENZIEN 33
2.8.2.1 PANSORBIN 33
2.8.2.2 HYPOTONISCHER PUFFER 33
2.8.2.3 SACCHAROSELOESUNG 33
2.8.2.4 WASCHPUFFER 33
2.8.2.5 AMMONIUMBIKARBONATPUFFER 34
2.8.3 DURCHFUEHRUNG 34
2.9 ANALYSE DER PROTEINE MIT DER SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE) 36
2.9.1 PRINZIP DER METHODE 36
2.9.2 REAGENZIEN 37
2.9.2.1 NATRIUMDODECYLSULFAT (SDS) 37
2.9.2.2 ACRYLAMIDSTAMMLOESUNG 37
2.9.2.3 TRENNGELPUFFER 37
2.9.2.4 SAMMELGELPUFFER 37
2.9.2.5 SACCHAROSELOESUNG 38
2.9.2.6 AMMONIUMPERSULFATLOESUNG (APS) 38
2
.
92.1
TETRAMETHYLETHYLENDIAMIN (TEMED) 38
2
.
92.8
PROBENPUFFER 38
2
.
92.9
BROMPHENOLBLAU-GLYCERINLOESUNG 38
2.9.2.10 ELEKTROPHORESEPUFFER 39
2.9.2.11 COOMASSIE-BLUE-FAERBELOESUNG 39
2.9.2.12 ENTFAERBELOESUNG 39
2.9.2.13 AMPLIFY-LOESUNG 39
2.9.3 DURCHFUEHRUNG 40
2.9.3.1 PRAEPARATION DES 7,5% -15% LINEAREN GRADIENTENGELS 40
2.9.3.2 PROBENVORBEREITUNG 42
2.9.3.3 ELEKTROPHORESE 42
2.9.4 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG DER PROTEINE IM SDS-POIYACRYLAMIDGEL
43
2.9.5 BEHANDLUNG DER GELE NACH DER ELEKTOPHORESE 44
2.10 WESTERN BLOT 45
2.10.1 PRINZIP DER METHODE 45
2.10.2 REAGENZIEN 46
2.10.2.1 TRANSFERPUFFER 46
2.10.2.2 AMIDOSCHWARZ-FAERBELOESUNG 46
2.10.2.3 ENTFAERBELOESUNG 46
2.10.2.4 BLOCKIERUNGS-PUFFER 46
2.10.2.5 INKUBATIONSPUFFER 46
2.10.2.6 WASCHLOESUNGEN 47
2.10.2.7 ANTIKOERPER 47
2.10.2.8 CHROMOGENES SUBSTRAT 47
2.10,3 DURCHFUEHRUNG 48
2.11 GERAETE 49
3.
ERGEBNISSE 50
3.1 AML-PATIENTENBLASTEN - MONOKLONALE ANTIKOERPER 50
3.2 IMMUNFLUORESZENZ-NACHWEIS MEMBRANASSOZIIERTER ANTIGENE 52
3.2.1 IMMUNFLUORESZENZ-ERGEBNISSE MIT AML-BLASTEN 53
3.2.2 IMMUNFLUORESZENZ-ERGEBNISSE MIT TUMORZELLINIEN 56
3.2.3 IMMUNFLUORESZENZ-ERGEBNISSE MIT PBL 58
3.3 ERGEBNISSE DER IMMUNPRAEZIPITATION 60
3.3.1 IMMUNPRAEZIPITATION MIT DEN TUMORZELLINIEN U-937 UND MONO MAC 6 61
3.3.2 IMMUNPRAEZIPITATION MIT DER AML NR. 35 61
3.4 ERGEBNISSE DER WESTERN BLOTS 64
3.4.1 WESTERN BLOT-ERGEBNISSE MIT DEM MAK II3G 65
3.4.2 WESTERN BLOT-ERGEBNISSE MIT DEN MAK D2F, A2D, F3A 65
3.5 IMMUNZYTOCHEMISCHER NACHWEIS INTRAZELLULAERER ANTIGENE 68
3.5.1 IMMUNZYTOCHEMISCHER ANTIGEN-NACHWEIS MIT DEM MAK D2F. 68
3.5.2 IMMUNZYTOCHEMISCHER ANTIGEN-NACHWEIS MIT DEN MAK A2D UND F3A 69
3.6 ZUSAMMENFASSENDE ERGEBNISDARSTELLUNG 72
4.
DISKUSSION 74
5. LITERATURVERZEICHNIS 80
6. DANKSAGUNG 96
7. LEBENSLAUF 97 |
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