Analyse der Promotoren ribosomaler Proteingene aus Schizosaccharomyces pombe: Charakterisierung des Elementes CAGTCACA als ein TATA-Box-Äquivalent
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| Published: |
1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
DER
TRANSKRIPTIONSINITIATIONSKOMPLEX
IN
EUKARYONTEN
1
1.2
AUFBAU
DES
TRANSKRIPTIONSINITIATIONSKOMPLEXES
4
1.3
DAS
TATA
BINDINGPROTEIN
SPIELT
EINE
ZENTRALE
ROLLE
IN
ALLEN
DREI
POLYMERASESYSTEMEN
6
1.4
REGULATION
DURCH
GENSPEZIFISCHE
AKTIVATOREN
9
1.5
AKTIVIERUNG
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
KOFAKTOREN
10
1.6
ALTERNATIVE
INITIATIONSKOMPLEXE
12
1.7
ALTERNATIVE
TRANSKRIPTIONSINITATION
BEI
RP
GENEN
12
1.8
REGULATION
RIBOSOMALER
GENE
12
1.9
REGULATION
DER
RIBOSOMALEN
PROTEINGENE
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
13
1.10
KONTROLLE
DER
SYNTHESE
RIBOSOMALER
PROTEINE
IN
HOEHEREN
EUKARYONTEN
AM
BEISPIEL
DER
MAUS
14
1.11
DIE
RIBOSOMALEN
PROTEINGENE
IN
SCHIZOSACCHARO
MYCES
POMBE
ALS
UNTERSUCHUNGSOBJEKT
16
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
18
2.1
ABKUERZUNGEN
18
2.2
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
19
22.1
CHEMIKALIEN
UND
NUKLEINSAEUREN
19
2.2.2
ENZYME
20
2.3
MEDIEN
UND
PUFFER
21
2.3.1
MEDIEN
ZUR
AUFZUCHT
VON
BAKTERIEN
21
2.3.2
MEDIEN
ZUR
AULZUCHT
VON
HEFEZELLEN
21
2.3.3
PUFFER
22
2.4
BAKTERIEN,
HEFEN,
PLASMIDE
23
2.4.1
BAKTERIENSTAEMME
23
2.4.2
HEFESTAEMME
24
2.4.3
TIEFKUEHLKULTUREN
24
2
4.4
PDW-232
24
2.4.5
PUC-18
25
2.5
PLASMID
UND
PHAGENISOLIERUNG
25
2.5.1
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
MIT
QIAGEN-ADSORPTIONSSAE
ULEN
25
2.5.2
PLASMIDISOLIERUNG
IN
KLEINEM
MASSSTAB
(MINIPRAEPARATION)
25
2.5.3
PHAGEN
EINZEL
UND
DOPPELSTRANGPRAEPARATION
26
2.6
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
27
2.6.1
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
DH5
27
2.6.2
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
DH5A
UND
BMH71-18
27
2.7
RESTRIKTIONSVERDAU,
DNA-LIGATION
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
28
2.8
DARSTELLUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
28
2.8.1
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
28
2.8.2
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
29
2.8.2.1
NATIVE
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
29
28.2.2
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
29
2.8.3
DNA
FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
AGAROSE
UND
POLYACRYLAMIDGELEN
30
2.8.3.1
ISOLIERUNG
DURCH
ELEKTROELUTION
30
2.8.3.2
ISOLIERUNG
DURCH
ADSORPTION
AN
QIAEX
(DIAGEN)
30
2.9
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
FRAGMENTEN
31
2.9.1
FRAGMENTMARKIERUNG
DURCH
"NICK-TRANSLATION
"
31
2.9.2
MARKIERUNG
VON
3'-ENDEN
VON
DS
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
"KLENOW-FILL-IN"
32
2.9.3
MARKIERUNG
VON
5'
FRAGMENTENDEN
DER
DNA
MITT4-KINASE
32
2.10
TRANSFORMATION
VON
HEFEN
33
2.10.1
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
S.POMBE
IM
KLEINEN
MASSSTAB
34
2.10.2
DNA:DNA
HYBRIDISIERUNG
NACH
SOUTHERN
34
2.10.3
X-GAL
PLATTENSCREENING
MIT
S.POMBE
ZELLEN
35
2.10.4
MESSUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
TRANSFORMIERTER
S.POMBE
ZELLEN
35
2.11
ISOLIERUNG
VON
GESAMT
RNA
AUS
HEFEN
36
2.11.1
RNA'.DNA
HYBRIDISIERUNG
(NORTHERN
-BLOT-ANALYSE)
37
2.11.1.1
DENATURIERENDE
RNA-GELELEKTROPHORESE
UND
TRANSFER
AUF
NYTRAN-FILTER
37
2.11.1.2
HYBRIDISIERUNG
DER
FIXIERTEN
RNA
MIT
MARKIERTER
DNA
SONDE
37
2.11.2
S1-NUKLEASE-KARTIERUNG
VON
MRNA5'-ENDEN
38
2.12
DNA
SEQUENZIERUNG
39
2.12.1
SEQUENZIERUNG
VON
EINZELSTRANG
DNA
39
2.12.2
DOPPELSTRANG
DNA
SEQUENZIERUNG
39
2.13
GERICHTETE
MUTAGENESE
40
2.13.1
KONSTRUKTION
DES
"GAPPED-DUPLEX"
M13-MP9-HYBRIDMOLEKUELS
41
2.13.2
HYBRIDISIERUNG
SYNTHETISCHER
OLIGINUKLEOTIDE
UND
AUFFUELLREAKTION
41
2.13.3
TRANSFEKTION
DES
MISCHPHAGEN
IN
E.COLI
BMH
71-18
MUTS
42
2.13.4
INFEKTION
UND
SELEKTIONIN
E.COLI
MK30-3
42
2.14
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
AUS
S.POMBE
PROT"
UND
S.CEREVISIAE
43
2.14.1
CHROMATOGRAPHIE
UEBER
HEPARIN-SEPHAROSE
44
2.14.2
BANDSHIFTGELE
44
2.14.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
UEBER
DNA-SEPHAROSE
46
2.14.4
DNA:PROTEIN
BINDUNG
IM
SOUTH-WESTERN
BLOT
46
3.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
48
3.1
DAS
LAC-Z
AUS
E.
COLI
ALS
REPORTERGEN
FUER
DEN
S.
POMBE
RP
GEN
PROMOTOR
DES
K5
48
3.1.1
KLONIERUNGSTRATEGIE:
49
3.1.2
SUBKLONIERUNG
DES
RP
GENS
K5
50
3.1.3
SUBKLONIERUNG
DES
LAC-Z
51
3.1.4
DIE
FUSIONSKONSTRUKTION
51
3.2
DER
EINFLUSS
VON
DELETIONEN
IM
K5
PROMOTOR:
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
55
3.2.1
PUC
18
K5
SSP
I
LAC-Z
L29-2
55
3.2.2
PUC
18
K5
NSI
I
LAC-Z
L29-2
55
3.2.3
PUC
18
K5
NSI
I
DEL
LAC-Z
L29-2
55
3.2.4
PUC
18
K5
NSI
I/NSI
I
LAC-Z
L29-2
55
3.2.5
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
DER
PROMOTORDELETIONEN
56
3.3
MUTAGENESE
DES
CAGTCACA
ELEMENTES
57
3.4
UEBERPRUEFUNG
DER
INTEGRIERTEN
KONSTRUKTIONEN
IM
SOUTHERNBLOT
59
3.5
DIE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
AUF
DER
EBENE
DER
MESSENGER
RNA
59
3.6
PROMOTORKONSTRUKTIONEN
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
61
3.7
ZUR
ABSCHAETZUNG
DES
POSITIONSEFFEKTES
WURDE
DAS
VEKTORSYSTEM
FUER
DIE
INTEGRATIONEN
GEWECHSELT
62
3.8
DER
EINFLUSS
VON
CAGTCACA
AUF
DIE
SELEKTION
DES
T
RANSKNPTIONSSTARTPUNKTES
64
3.9
BANDSHIFTEXPERIMENTE
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DES
CAGTCACA
ELEMENTES
ALS
PROTEINBINDUNGSSEQUENZ
67
3.9.1
BANDSHIFTEXPERIMENTE
MIT
ROHEXTRAKTEN
67
3.9.2
BANSHIFTEXPERIMENTE
MIT
PARTIELL
GEREINIGTEN
PROTEINEN
70
3.9
3
KOMPETITIONEN
MIT
PROMOTOREN
ANDERER
S.
POMBE
RP
GENE
72
3.9.4
BANDSHIFTEXPERIMENTE
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
74
3.9.5
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DES
PROTEINKOMPLEXES
75
3.9.6
DIE
WEITERE
AUFREINIGUNG
DES
PARTIELL
GEREINIGTEN
PROTEINS
UEBER
EINE
AFFINITAETSSAEULE
79
3.9.7
NACHWEIS
DES
SPEZIFISCHEN
BINDUNGSPROTEINS
IM
SOUTH
WESTERN
80
3.10
BANDSHIFTS
MIT
EINEM
OLIGONUKLEOTID,
IN
DEM
CAGTCACA
GEGEN
DAS
TATA
ELEMENT
TATAAATAG
AUSGETAUSCHT
WURDE
82
3.10.1
DER
FAKTOR,
DER
CAGTCACA
BINDET,
KANN
DIE
TATA-BOX
NICHT
ERKENNEN.
82
3.10.2
DIE
K5
PROMOTORSEQUENZ,
DIE
DAS
ARTIFIZIELLE
TATA
ELEMENT
ENTHAELT
IST
IN
VIVO
TRNASKRIPTIONSAKTIV
84
3.10.3
PROMOTORVERLAENGERUNGEN
MIT
DEM
STROMAUFWAERTS
LIEGENDEN
BEREICH
DES
K5
PROMOTORS
84
3.11
BANDSHIFTEXPERIMENTE
MIT
S.
CEREVISIAE
ROHEXTRAKT
86
3.12
CHARAKTERISIERUNG
DES
STROMAUFWAERTS
LIEGENDEN
ELEMENTES
ACCCTACCCT
AM
BEISPIEL
DES
L29-2
RP
PROMOTORS
88
3.12.1
LAC-Z
KONSTRUKTIONEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
ACCCTACCCT
(E)
89
3.12.2
DAS
ACCCTACCCT
ELEMENT
IST
AUCH
MIT
DEM
STROM
ABWAERTS
GELEGENEN
BEREICH
DES
K5
PROMOTORS
IN
DER
LAGE
DEN
LEVEL
DER
TRANSKRIPTION
ANZUHEBEN
92
4.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
UND
ABSCHLIESSENDE
DISKUSSION
94
4.1
LOKALISATION
PUTATIVER
CIS
ELEMENTE
IM
K5
RP
PROMOTOR
AUS
S.
POMBE
94
4.2
DER
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
INNERHALB
DES
CAGTCACA
ELEMENTS
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
95
4.3
DER
EINFLUSS
DER
MUTATIONEN
IM
CAGTCACA
ELEMENT
AUF
DIE
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTE
96
44
CAGTCACA
IST
DIE
ZIELSEQUENZ
EINES
NEUEN
PROETEINFAKTORS
97
4.5
DER
STROMAUFWAERTSLIEGENDE
PROMOTORBEREICH
DES
K5
KANN
DIE
BASALE
AKTIVITAET
DER
TATA-BOX
NICHT
AKTIVIEREN
98
4.6
DER
EINFLUSS
DES
ELEMENTES
ACCCTACCCT
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
99
4.7
ZUSAMMENFASSUNG
100
LITERATURVERZEICHNIS
101 |
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