Molekulare Charakterisierung der Dhmst101-Gene von Drosophila hydei: eine vom Y-Chromosom beeinflußte Familie ungewöhnlich strukturierter Spermienschwanzproteine
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGEN
VI
I
EINLEITUNG
1
II
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
LOESUNGEN
UND
CHEMIKALIEN
9
2.2
BIOLOGISCHES
MATERIAL
11
2.2.1
DROSOPHILA
HYDEI-STAEMTNE
11
2.2.2
BAKTERIENSTAEMME
11
2.2.3
VEKTOREN
12
2.2.4
PRIMER
12
2.3
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
13
2.3.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
13
2.3.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
13
2.3.3
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
ADULTEN
FLIEGEN
14
2.3.4
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
15
2.3.5
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
ADULTEN
FLIEGEN
16
2.4
KLONLERUNGSTECHNIKEN
17
2.4.1
RESTRIKTIONSANALYSE
GENOMISCHER
DNA
17
2.4.2
RESTRIKTION
VON
PLASMID-DNA
17
2.4.3
ETHANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
17
2.4.4
FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
QIAEX
18
2.4.5
5'-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
VEKTOR-DNA
19
2.4.6
AUFFUELLREAKTION
MIT
KLENOW-FRAGMENT
19
2.4.7
LIGATIORR
20
2.4.8
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/I-ZELLEN
20
2.4.8.1
HERSTELLUNGKOMPETENTERZELLEN
20
2.4.8.2
TRANSFORMATION
21
2.5
TECHNIKEN
ZUR
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
21
2.5.1
HERSTELLUNG
RADIOAKTIVER
DNA-PROBEN
DURCH
"RANDOM-PRIMED-LABELING"
21
2.5.2
5'-ENDMARKIERUNG
22
2.5.3
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
IN
VITRO-TRANSKRIPTE
23
2.5.4
HERSTELLUNG
DIGOXIGENIERTER
HYBRIDISIERUNGSPROBEN
23
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.4.2
DIGOXIGENIERTE
RNA-PROBEN
24
2.6
TRANSFERTECHNIKEN
25
2.6.1
"NORTHERN
BLOT"
25
2.6.2
"SOUTHERN
BLOT"
25
2.6.3
"PLAQUE
LIFT
'
-TRANSFER
26
2.6.4
FILTER
FUER
DIE
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
26
2.7
HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
26
2.7.1
HYBRIDISIERUNG
AUF
DNA-FILTER
26
2.7.2
HYBRIDISIERUNG
AUF
RNA-FILTER
27
2.7.3
DETEKTION
RADIOAKTIVER
HYBRIDISIERUNG
28
2.8
IN
SUEU-HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN
28
2.8.1
ZN
SITU-HYBRIDISIERUNG
AUF
PARAFFINSCHNITTE
28
2.8.1.1
HERSTELLUNG
DER
PARAFFINSCHNITTE
28
2.8.1.2
VORBEHANDLUNG
DER
OBJEKTTRAEGER
29
2.8.1.3
IN
SIRU-HYBRIDISIERUNG
AUF
SCHNITTPRAEPARATE
29
2.8.1.4
DETEKTION
DIGOXIGENIERTER
RNA-PROBEN
30
2.8.2
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
AUF
POLYTAENE
CHROMOSOMEN
31
2.8.2.1
PRAEPARATION
VON
POLYTAENE
CHROMOSOMEN
AUS
SPEICHELDRUESEN
31
2.8.2.2
DURCHFUEHRUNG
DER
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
32
2.8.2.3
DETEKTION
DIGOXIGENIERTER
PROBEN
AUF
POLYTAENCHROMOSOMEN
32
2.9
VERKUERZUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
EXONUKLEASE
HI
UND
NUKLEASE
S1
BEHANDLUNG
33
2.10
SEQUENZIERUNG
34
2.11
"PRIMER
EXTENSION"-ANAIYSE
36
2.12
AMPLIFLZIERUNG
GENOMISCHER
DNA
MIT
HILFE
DER
PCR-TECHNIK
37
2.13
ELEKTROPHORESETECHNIKEN
38
2.13.1
STANDARD-AGAROSEGEL
38
2.13.2
DENATURIERENDES
FORMALDEHYD-AGAROSEGEL
38
2.13.3
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
39
2.13.4
DENATURIERENDES
POLYACRYLAMIDGEL
40
2.14
PROTEINCHEMISCHE
TECHNIKEN
41
2.14.1
ISOLATION
VON
GESAMTPROTEIN
AUS
ADULTEN
HODEN
41
2.14.2
AUFREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
AUS
BAKTERIENEXTRAKTEN
42
2.14.2.1
AUFREINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
UEBER
GLUTHATIONSEPHAROSE
4B
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
42
2.14.2.2
AUFREINIGUNG
VON
HISTIDIN-FUSIONSPROTEINEN
UEBER
NICKELAGAROSE
UNTER
DENATURIENDEN
BEDINGUNGEN
42
2.14.3
ACETONFAELLUNG
VON
PROTEINEN
44
INHALTSVERZEICHNIS
2.14.4
FAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
44
2.14.5
REVERSIBELE
FAERBUNG
VON
"WESTERN
BLOTS"
44
2.15
HERSTELLUNG
MONOSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
45
2.15.1
GEWINNUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
45
2.15.2
KOPPLUNG
DES
SYNTHETISCHEN
PEPTIDS
AN
BSA
DURCH
VERNETZUNG
MIT
GLUTARALDEHYD
45
2.15.3
AUFREINIGUNG
MONOSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
46
2.16
"WESTERN
BLOT"-ANALYSE
ZUR
SERUMCHARAKTERISIERUNG
46
2.16.1
"SEMI
DRY
BLOT"
46
2.16.2
IMMUNUMSETZUNG
VON
PROTEINFIITEM
47
2.17
IMMUNLOKALISIERUNG
47
2.17.1
IMMUNLOKALISIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
PARAFFINSCHNITTEN
47
2.17.2
IMMUNLOKALISIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
HODENQUETSCHPRAEPARATEN
48
2.18
ULTRASTRUKTURELLE
IMMUNLOKALISIERUNG
IM
HODEN
VON
DROSOPHILA
HYDEI
49
2.18.1
PRAEPARATION
UND
FIXIERUNG
DES
HODENGEWEBES
49
2.18.2
EINBETTUNG
DES
GEWEBES
IN
LR-GOLD
49
2.18.3
ULTRAMIKROTOMIE
50
2.18.4
IMMUNLOKALISIERUNG
51
2.18.5
SCHNITTKONTRASTIERUNG
52
2.18.6
AUSWERTUNG
IM
ELEKTRONENMIKROSKOP
52
III
ERGEBNISSE
53
3.1
VORAUSSETZUNGEN
FUER
DIE
ARBEIT
53
3.2
SEQUENZANALYSE
DER
XGTLL-PHAGENKLONE
HYDAX27,
33
UND
27.4.H
54
3.3
"NORTHERN
BLOT"-ANALYSE
54
3.4
LOKALISIERUNG
DER
MRNA
DURCH
IN
SITU-HYBRIDLSIERUNG
UND
"NORTHERN
BLOT"-ANALYSE
56
3.5
ERGEBNIS
DER
IN
SITU-HYBRIDLSIERUNG
AUF
POLYTAENE
CHROMOSOMEN
58
3.6
ANALYSE
GENOMISCHER
PHAGENKLONE
59
3.6.1
ISOLIERUNG
DER
GENOMISCHEN
PHAGENKLONE
59
3.6.2
RESTRIKTIONSANALYSE
GENOMISCHER
PHAGENKLONE
UND
ERSTELLUNG
EINER
RESTRIKTIONSKARTE
60
3.7
SEQUENZIERUNG
DER
GENOMISCHEN
FRAGMENTE
65
3.7.1
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE
65
3.8
"PRIMER
EXTENSION"-ANALYSE
DER
DHMSTLOL-GENE
69
3.8.1
"PRIMER
EXTENSION"-ANALYSE
VON
DHMSTLOL(L)
69
INHALTSVERZEICHNIS
3.8.2
"PRIMER
EXTENSION"-ANALYSE
VON
DHMSTL01(2)
70
3.9
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
DHMSTL01(2)-GENS
DURCH
"NORTHERN
BLOT"
UND
IN
SITU-HYBRIDISIERUNGEN
71
3.10
"SOUTHERN
BLOT"-ANALYSEN
71
3.10.1
KLAERUNG
DER
FRAGMENTGROESSENVARIATION
IN
EINZELNEN
D.
HYDEI
STAEMMEN
71
3.10.1.1
VARIATION
IM
DHMSTL01(L)-GEN
71
3.10.1.2
VARIATION
IM
DHMSTL01(2)-GEN
74
3.10.2
NACHWEIS
DER
DHMSTLO
L-GENE
IN
ANDEREN
DROSOP/IITA-SPEZIES
DURCH
"SOUTHERN
BLOT"-ANALYSE
75
3.11
NACHWEIS
DER
GROESSENVARIATION
IM
DHMSTL01(L)-GEN
DURCH
PCR-ANALYSE
UND
"WESTERN
BLOT"-ANALYSE
77
3.12
CHARAKTERISIERUNG
DER
DHMSTLOL-GENPRODUKTE
79
3.12.1
ANALYSE
DES
DHMST
10
L(L)-GENPRODUKTES
79
3.12.2
ANALYSE
DES
DHMSTL01(2)-GENPRODUKTES
80
3.13
HERSTELLUNG
VON
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS
DHMSTLOL(L)
GENPRODUKT
82
3.13.1
HERSTELLUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
83
3.13.2
VERSUCHE
ZUR
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
85
3.13.3
HERSTELLUNG
MONOSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
85
3.13.3.1
IMMUNISIERUNG
85
3.13.3.2
GEWINNUNG
MONOSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
87
3.14
"WESTERN
BLOT"-ANALYSE
ZUR
LOKALISIERUNG
DES
DHMSTL01(L)-GEN
PRODUKTS
INNERHALB
DES
HODENS
VON
D.
HYDEI
89
3.15
NACHWEIS
DES
DHMSTL01(L)-GENPRODUKTES
IN
HODENQUETSCH
PRAEPARATEN
VON
D.
HYDEI
91
3.16
IMMUNHISTOLOGIE
AUF
PARAFFINSCHNITTEN
93
3.17
ULTRASTRUKTURELLE
LOKALISIERUNG
DES
DHMSTL01(L)-PROTEINS
DURCH
IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE
95
3.18
EINFLUSS
Y-CHROMOSOMALER
DEFIZIENZEN
AUF
DAS
DHMSTLOL(L)
GENPRODUKT
99
3.19
ANHANG:
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
103
3.19.1
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
DER
CDNA-KLONE
103
3.19.2
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
DER
GENOMISCHEN
KLONE
104
IV
DISKUSSION
109
4.1
PROBLEMSTELLUNG
109
4.2
DHMSTLOL
IST
EINE
FAMILIE
TESTISSPEZIFISCH
EXPREMIERTER
GENE
110
INHALTSVERZEICHNIS
4.3
SEQUENZANALYSE
DER
DHMSTLOL-GENE
112
4.4
ANZAHL
UND
EXPRESSION
DER
DHMSTLOL-GENE
114
4.5
DIE
DHMSTLOL-GENE
KOENNEN
NUR
IN
ENG
VERWANDTEN
DROSOPHILA-SPEZIES
NACHGEWIESEN
WERDEN
117
4.6
DIE
MEISTEN
DHMSTLOL-GENE
ZEIGEN
GROESSENVARIATION
IN
VERSCHIEDENEN
DROSOPHILA
STAEMMEN
118
4.7
HERSTELLUNG
UND
QUALITAET
DER
VERWENDETEN
MONOSPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER
119
4.8
FUNKTION
DES
DHMSTL01(L)-GENPRODUKTES
121
4.9
EINFLUSS
DES
Y-CHROMOSOMS
AUF
DAS
DHMSTL01(L)-GENPRODUKT
124
4.10
AUSBLICK
127
V
ZUSAMMENFASSUNG
129
VI
LITERATURVERZEICHNIS
130
VII
ANMERKUNGEN
140 |
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