Holdings: Molekulare Charakterisierung der Dhmst101-Gene von Drosophila hydei

Molekulare Charakterisierung der Dhmst101-Gene von Drosophila hydei: eine vom Y-Chromosom beeinflußte Familie ungewöhnlich strukturierter Spermienschwanzproteine

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Bibliographic Details
Main Author:	Neesen, Jürgen (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	1993
Subjects:	Drosophila hydei Hochschulschrift Dhmst101-Gen
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I ABKUERZUNGEN VI I EINLEITUNG 1 II MATERIAL UND METHODEN 9 2.1 LOESUNGEN UND CHEMIKALIEN 9 2.2 BIOLOGISCHES MATERIAL 11 2.2.1 DROSOPHILA HYDEI-STAEMTNE 11 2.2.2 BAKTERIENSTAEMME 11 2.2.3 VEKTOREN 12 2.2.4 PRIMER 12 2.3 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 13 2.3.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA DURCH ALKALISCHE LYSE 13 2.3.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB 13 2.3.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS ADULTEN FLIEGEN 14 2.3.4 ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA 15 2.3.5 ISOLIERUNG VON RNA AUS ADULTEN FLIEGEN 16 2.4 KLONLERUNGSTECHNIKEN 17 2.4.1 RESTRIKTIONSANALYSE GENOMISCHER DNA 17 2.4.2 RESTRIKTION VON PLASMID-DNA 17 2.4.3 ETHANOLFAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 17 2.4.4 FRAGMENTISOLIERUNG AUS AGAROSEGELEN MIT QIAEX 18 2.4.5 5'-DEPHOSPHORYLIERUNG VON VEKTOR-DNA 19 2.4.6 AUFFUELLREAKTION MIT KLENOW-FRAGMENT 19 2.4.7 LIGATIORR 20 2.4.8 TRANSFORMATION VON E. CO/I-ZELLEN 20 2.4.8.1 HERSTELLUNGKOMPETENTERZELLEN 20 2.4.8.2 TRANSFORMATION 21 2.5 TECHNIKEN ZUR MARKIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 21 2.5.1 HERSTELLUNG RADIOAKTIVER DNA-PROBEN DURCH "RANDOM-PRIMED-LABELING" 21 2.5.2 5'-ENDMARKIERUNG 22 2.5.3 HERSTELLUNG RADIOAKTIV MARKIERTER IN VITRO-TRANSKRIPTE 23 2.5.4 HERSTELLUNG DIGOXIGENIERTER HYBRIDISIERUNGSPROBEN 23 INHALTSVERZEICHNIS 2.5.4.2 DIGOXIGENIERTE RNA-PROBEN 24 2.6 TRANSFERTECHNIKEN 25 2.6.1 "NORTHERN BLOT" 25 2.6.2 "SOUTHERN BLOT" 25 2.6.3 "PLAQUE LIFT ' -TRANSFER 26 2.6.4 FILTER FUER DIE KOLONIEHYBRIDISIERUNG 26 2.7 HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN 26 2.7.1 HYBRIDISIERUNG AUF DNA-FILTER 26 2.7.2 HYBRIDISIERUNG AUF RNA-FILTER 27 2.7.3 DETEKTION RADIOAKTIVER HYBRIDISIERUNG 28 2.8 IN SUEU-HYBRIDISIERUNGSTECHNIKEN 28 2.8.1 ZN SITU-HYBRIDISIERUNG AUF PARAFFINSCHNITTE 28 2.8.1.1 HERSTELLUNG DER PARAFFINSCHNITTE 28 2.8.1.2 VORBEHANDLUNG DER OBJEKTTRAEGER 29 2.8.1.3 IN SIRU-HYBRIDISIERUNG AUF SCHNITTPRAEPARATE 29 2.8.1.4 DETEKTION DIGOXIGENIERTER RNA-PROBEN 30 2.8.2 IN SITU-HYBRIDISIERUNG AUF POLYTAENE CHROMOSOMEN 31 2.8.2.1 PRAEPARATION VON POLYTAENE CHROMOSOMEN AUS SPEICHELDRUESEN 31 2.8.2.2 DURCHFUEHRUNG DER IN SITU-HYBRIDISIERUNG 32 2.8.2.3 DETEKTION DIGOXIGENIERTER PROBEN AUF POLYTAENCHROMOSOMEN 32 2.9 VERKUERZUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH EXONUKLEASE HI UND NUKLEASE S1 BEHANDLUNG 33 2.10 SEQUENZIERUNG 34 2.11 "PRIMER EXTENSION"-ANAIYSE 36 2.12 AMPLIFLZIERUNG GENOMISCHER DNA MIT HILFE DER PCR-TECHNIK 37 2.13 ELEKTROPHORESETECHNIKEN 38 2.13.1 STANDARD-AGAROSEGEL 38 2.13.2 DENATURIERENDES FORMALDEHYD-AGAROSEGEL 38 2.13.3 SDS-POLYACRYLAMIDGEL 39 2.13.4 DENATURIERENDES POLYACRYLAMIDGEL 40 2.14 PROTEINCHEMISCHE TECHNIKEN 41 2.14.1 ISOLATION VON GESAMTPROTEIN AUS ADULTEN HODEN 41 2.14.2 AUFREINIGUNG VON FUSIONSPROTEINEN AUS BAKTERIENEXTRAKTEN 42 2.14.2.1 AUFREINIGUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN UEBER GLUTHATIONSEPHAROSE 4B UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN 42 2.14.2.2 AUFREINIGUNG VON HISTIDIN-FUSIONSPROTEINEN UEBER NICKELAGAROSE UNTER DENATURIENDEN BEDINGUNGEN 42 2.14.3 ACETONFAELLUNG VON PROTEINEN 44 INHALTSVERZEICHNIS 2.14.4 FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 44 2.14.5 REVERSIBELE FAERBUNG VON "WESTERN BLOTS" 44 2.15 HERSTELLUNG MONOSPEZIFISCHER ANTIKOERPER 45 2.15.1 GEWINNUNG EINES POLYKLONALEN ANTISERUMS 45 2.15.2 KOPPLUNG DES SYNTHETISCHEN PEPTIDS AN BSA DURCH VERNETZUNG MIT GLUTARALDEHYD 45 2.15.3 AUFREINIGUNG MONOSPEZIFISCHER ANTIKOERPER 46 2.16 "WESTERN BLOT"-ANALYSE ZUR SERUMCHARAKTERISIERUNG 46 2.16.1 "SEMI DRY BLOT" 46 2.16.2 IMMUNUMSETZUNG VON PROTEINFIITEM 47 2.17 IMMUNLOKALISIERUNG 47 2.17.1 IMMUNLOKALISIERUNG VON PROTEINEN IN PARAFFINSCHNITTEN 47 2.17.2 IMMUNLOKALISIERUNG VON PROTEINEN IN HODENQUETSCHPRAEPARATEN 48 2.18 ULTRASTRUKTURELLE IMMUNLOKALISIERUNG IM HODEN VON DROSOPHILA HYDEI 49 2.18.1 PRAEPARATION UND FIXIERUNG DES HODENGEWEBES 49 2.18.2 EINBETTUNG DES GEWEBES IN LR-GOLD 49 2.18.3 ULTRAMIKROTOMIE 50 2.18.4 IMMUNLOKALISIERUNG 51 2.18.5 SCHNITTKONTRASTIERUNG 52 2.18.6 AUSWERTUNG IM ELEKTRONENMIKROSKOP 52 III ERGEBNISSE 53 3.1 VORAUSSETZUNGEN FUER DIE ARBEIT 53 3.2 SEQUENZANALYSE DER XGTLL-PHAGENKLONE HYDAX27, 33 UND 27.4.H 54 3.3 "NORTHERN BLOT"-ANALYSE 54 3.4 LOKALISIERUNG DER MRNA DURCH IN SITU-HYBRIDLSIERUNG UND "NORTHERN BLOT"-ANALYSE 56 3.5 ERGEBNIS DER IN SITU-HYBRIDLSIERUNG AUF POLYTAENE CHROMOSOMEN 58 3.6 ANALYSE GENOMISCHER PHAGENKLONE 59 3.6.1 ISOLIERUNG DER GENOMISCHEN PHAGENKLONE 59 3.6.2 RESTRIKTIONSANALYSE GENOMISCHER PHAGENKLONE UND ERSTELLUNG EINER RESTRIKTIONSKARTE 60 3.7 SEQUENZIERUNG DER GENOMISCHEN FRAGMENTE 65 3.7.1 SEQUENZIERUNGSSTRATEGIE 65 3.8 "PRIMER EXTENSION"-ANALYSE DER DHMSTLOL-GENE 69 3.8.1 "PRIMER EXTENSION"-ANALYSE VON DHMSTLOL(L) 69 INHALTSVERZEICHNIS 3.8.2 "PRIMER EXTENSION"-ANALYSE VON DHMSTL01(2) 70 3.9 NACHWEIS DER EXPRESSION DES DHMSTL01(2)-GENS DURCH "NORTHERN BLOT" UND IN SITU-HYBRIDISIERUNGEN 71 3.10 "SOUTHERN BLOT"-ANALYSEN 71 3.10.1 KLAERUNG DER FRAGMENTGROESSENVARIATION IN EINZELNEN D. HYDEI STAEMMEN 71 3.10.1.1 VARIATION IM DHMSTL01(L)-GEN 71 3.10.1.2 VARIATION IM DHMSTL01(2)-GEN 74 3.10.2 NACHWEIS DER DHMSTLO L-GENE IN ANDEREN DROSOP/IITA-SPEZIES DURCH "SOUTHERN BLOT"-ANALYSE 75 3.11 NACHWEIS DER GROESSENVARIATION IM DHMSTL01(L)-GEN DURCH PCR-ANALYSE UND "WESTERN BLOT"-ANALYSE 77 3.12 CHARAKTERISIERUNG DER DHMSTLOL-GENPRODUKTE 79 3.12.1 ANALYSE DES DHMST 10 L(L)-GENPRODUKTES 79 3.12.2 ANALYSE DES DHMSTL01(2)-GENPRODUKTES 80 3.13 HERSTELLUNG VON SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN GEGEN DAS DHMSTLOL(L) GENPRODUKT 82 3.13.1 HERSTELLUNG VON FUSIONSPROTEINEN 83 3.13.2 VERSUCHE ZUR HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 85 3.13.3 HERSTELLUNG MONOSPEZIFISCHER ANTIKOERPER 85 3.13.3.1 IMMUNISIERUNG 85 3.13.3.2 GEWINNUNG MONOSPEZIFISCHER ANTIKOERPER 87 3.14 "WESTERN BLOT"-ANALYSE ZUR LOKALISIERUNG DES DHMSTL01(L)-GEN PRODUKTS INNERHALB DES HODENS VON D. HYDEI 89 3.15 NACHWEIS DES DHMSTL01(L)-GENPRODUKTES IN HODENQUETSCH PRAEPARATEN VON D. HYDEI 91 3.16 IMMUNHISTOLOGIE AUF PARAFFINSCHNITTEN 93 3.17 ULTRASTRUKTURELLE LOKALISIERUNG DES DHMSTL01(L)-PROTEINS DURCH IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE 95 3.18 EINFLUSS Y-CHROMOSOMALER DEFIZIENZEN AUF DAS DHMSTLOL(L) GENPRODUKT 99 3.19 ANHANG: NUKLEINSAEURESEQUENZEN 103 3.19.1 NUKLEINSAEURESEQUENZEN DER CDNA-KLONE 103 3.19.2 NUKLEINSAEURESEQUENZEN DER GENOMISCHEN KLONE 104 IV DISKUSSION 109 4.1 PROBLEMSTELLUNG 109 4.2 DHMSTLOL IST EINE FAMILIE TESTISSPEZIFISCH EXPREMIERTER GENE 110 INHALTSVERZEICHNIS 4.3 SEQUENZANALYSE DER DHMSTLOL-GENE 112 4.4 ANZAHL UND EXPRESSION DER DHMSTLOL-GENE 114 4.5 DIE DHMSTLOL-GENE KOENNEN NUR IN ENG VERWANDTEN DROSOPHILA-SPEZIES NACHGEWIESEN WERDEN 117 4.6 DIE MEISTEN DHMSTLOL-GENE ZEIGEN GROESSENVARIATION IN VERSCHIEDENEN DROSOPHILA STAEMMEN 118 4.7 HERSTELLUNG UND QUALITAET DER VERWENDETEN MONOSPEZIFISCHEN ANTIKOERPER 119 4.8 FUNKTION DES DHMSTL01(L)-GENPRODUKTES 121 4.9 EINFLUSS DES Y-CHROMOSOMS AUF DAS DHMSTL01(L)-GENPRODUKT 124 4.10 AUSBLICK 127 V ZUSAMMENFASSUNG 129 VI LITERATURVERZEICHNIS 130 VII ANMERKUNGEN 140
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