Expression des neurotrophen Faktors CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) unter der Kontrolle eines neuronenspezifischen Promotors:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DAS
NEUROTROPHE
KONZEPT
1
1.2.
NERVENWACHSTUMSFAKTOR
UND
ANDERE
NEUROTROPHINE
3
1.3.
CILIARY
NEUROTROPHIC
FACTOR
8
1.4.
STRATEGIEN
ZUR
KLAERUNG
DER
IN
VIVO
FUNKTION
VON
CNTF
12
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
DER
DOKTORARBEIT
12
2.
ABKUERZUNGEN
UND
BEGRIFFE
17
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
18
3.1.
MATERIAL
18
3.1.1.
GERAETE
18
3.1.2.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
18
3.1.3.
MEDIEN
UND
SUBSTRATE
19
3.1.4.
ENZYME
UND
KITS
20
3.1.5.
BAKTERIENSTAEMME,
VEKTOREN,
GENBANKEN
UND
ANTISEREN
20
II
3.1.6.
ZELLINIEN
UND
TIERE
21
3.1.7.
ALLGEMEINES
21
3.2.
METHODEN
22
3.2.1.
MOLEKULARBIOLOAISCHE/AENTECHNOLOAISCHE
METHODEN
22
3.2.1.1.
RESTRIKTIONSANALYSE
22
3.2.1.2.
QUANTITATIVE
NUKLEINSAEUREBESTIMMUNG
22
3.2.1.3.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
AGAROSEGELEN
22
3.2.1.4.
PRAEPARATION
VON
LAMBDA
PHAGEN-DNA
23
3.2.1.5.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
23
3.2.1.6.
PRAEPARATION
VON
GENOMISCHER
MAUS-DNA
AUS
SCHWANZGEWEBE
24
3.2.1.7.
EXTRAKTION
VON
GESAMT-RNA
24
3.2.1.8.
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
AUF
NYLONMEMBRANEN
25
3.2.1.9.
SUBKLONIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
28
3.2.1.10.
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
29
3.2.1.11.
POLYMERASEKETTENREAKTION
29
3.2.1.12.
DNA-SEQUENZIERUNG
30
III
3.2.2.
ZELLKULTUR
UND
BIOASSAVS
31
3.2.2.1.
HERSTELLUNG
VON
KULTURMEDIEN
31
32.2.2.
KULTUR
VON
PC12
ZELLEN
31
3.2.2.3.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
PC12
ZELLEN
UND
SELEKTION
31
3.2.2.4.
DIFFERENZIERUNG
VON
PC12
ZELLEN
MIT
NGF
32
3.2.2.5.
UEBERLEBENSTEST
MIT
E8
HUEHNCHENZILIARNEURONEN
32
3.2
2.6.
KULTUR
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
32
3.2.27.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
UND
SELEKTION
34
3.2.2.8.
DIFFERENZIERUNG
VON
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
35
3.2.3.
PRODUKTION
TRANSGENER
TIERE
36
3.2.3.1.
EMBRYONALE
STAMMZELLEN-TECHNOLOGIE
36
3.2.3.2.
PRONUKLEUSINJEKTION
36
IV
4.
4.1.
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.2.
4.2.1.
4.2.1.1.
4.2.1.2.
4.3.
4.3.1.
4.3.1.1.
4.3.1.2.
4.3.1.3.
ERGEBNISSE
38
PNSC:
VEKTOR
ZUR
NEURONENSPEZIFISCHEN
EXPRESSION
VON
CNTF
38
KLONIERUNG
DES
SCG10-PROMOTORS
DER
MAUS
38
KLONIERUNG
EINES
MODIFIZIERTEN
CNTF-GENS
DER
MAUS
ZUR
EXPRESSION
EINER
SEKRETORISCHEN
FORM
42
KONSTRUKTION
DES
VEKTORS
PNSC
ZUR
NEURONENSPEZIFISCHEN
EXPRESSION
VON
CNTF
45
EXPRESSION
DES
MODIFIZIERTEN
CNTFS
IN
PC
12
ZELLEN
48
TRANSFEKTION
VON
PC12
ZELLEN
MIT
PNSC
UND
NGF-INDUKTION
48
CNTF-BIOAKTIVITAET
IM
MEDIUM
TRANSFIZIERTER
PC12
ZELLEN
50
NACHWEIS
VON
CNTF-MRNA
IN
TRANSFIZIERTEN
PC12
ZELLEN
51
PRODUKTION
TRANSAENER
MAEUSE
56
EMBRYONALE
STAMMZELLEN-TECHNOLOAIE
56
TRANSFEKTION
EMBRYONALER
STAMMZELLEN
MIT
PNSC
57
KARYOTYPANALYSE
UND
DIFFERENZIERUNG
TRANSFIZIERTER
STAMMZELLEN
58
AKTIVITAET
DES
SCG10P
RORNO
T
OR
CNTF-KONSTRUKTS
IN
DEN
TRANSFIZIERTEN
STAMMZELLEN
60
V
4.3.1.4.
BLASTOZYSTENINJEKTION
64
4.3.2.
PRONUKLEUSINIEKTION
64
4.3.2.1.
GENOMISCHER
SOUTHERN
BLOT
ZUR
IDENTIFIKATION
TRANSGENER
MAEUSE
65
5.
DISKUSSION
68
5.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
CNTF-GENS
DER
MAUS
68
5.2.
KLONIERUNG
DES
SCG10-PROMOTORS
DER
MAUS,
EIN
NSRE
ENTHALTENDER
PROMOTOR
69
5.3.
SCG10P
ROMO
T
OR
CNTFQ
EN
-KONSTRUKT
IN
PC12
ZELLEN
NACH
NGF-INDUKTION
VERLAEUFT
PARALLEL
ZUR
ENDOGENEN
SCG10-EXPRESSION
70
5.4.
UNERWARTETE
EXPRESSION
VON
TRANSGENEM
CNTF
UND
ENDOGENEM
SCG10
IN
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
71
5.5.
TRANSGENE
MAEUSE
73
5.6.
AUSBLICK
75
6.
LITERATUR
78
7.
DANKSAGUNG
93
8.
LEBENSLAUF
94
9.
ZUSAMMENFASSUNG
95 |
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