Ermittlung der cDNA Sequenz des Varianzglykoproteins aus Trypanosoma congolense (Broden, 1904) BeNat 1.3:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
CHARAKTERISIERUNG
UND
ENTWICKLUNGSZYKLUS
VON
TRYPANOSOMA
CONGOLENSE
.
1
1.1.1
ENTWICKLUNGSZYKLUS
UND
UEBERTRAGUNG
.
3
1.1.2
ANTIGENVARIATION
.
3
1.2
FUNKTION
UND
STRUKTUR
VON
TRYPANOSOMA
BRUCEI
VSGS
.
6
1.2.1
POLYPEPTIDKETTE
.
6
1.2.2
DER
GLYKOSYL-PHOSPHATIDYL-INOSITOL
(GPI
)
MEMBRANANKER.
.
10
1.2.3
KOHLENHYDRATE
.
11
1.2.4
SEKUNDAER
UND
TERTIAERSTRUKTUR
.
11
1.3
STRUKTUR
VON
TRYPANOSOMA
CONGOLENSE
VSGS
.
12
1.4
GENETIK
DER
ANTIGENVARIATION
.
13
1.4.1
KLASSIFIKATION
DER
CHROMOSOMEN
BEI
TRYPANOSOMEN
.
13
1.4.2
VSG-GEN
EXPRESSION
.
14
1.4.3
TELOMEMAHE
VSG-GENE
.
14
1.4.4
MODELLE
FUER
AKTIVIERUNG
VON
VSG-GENEN
.
15
1.4.5
TRANSKRIPTION
VON
VSG-GENEN
.
16
2
ZIEL
DER
VORLIEGENDEN
AIBEIT
.
19
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
20
3.1
MRNA-ISOLIERUNG
.
20
3.1.1
ANZUCHT
UND
ISOLIERUNG
DER
TRYPANOSOMEN
.
20
3.1.2
EXTRAKTION
DER
GESAMT-RNA
.
21
3.1.3
EXTRAKTION
DER
MRNA
AUS
DER
GESAMT-RNA
.
22
3.1.3.1
MRNA
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
23
3.1.3.2
"IN
VITRO"-TRANSLATION
.
23
3.1.3.3
TRICHLORESSIGSAEURE-FAELLUNG
.
24
3.1.3.4
IMMUNPRAEZIPITATION
.
24
3.1.3.5
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYAKRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
25
3.2
HERSTELLUNG
DER
CDNA-BIBLIOTHEK
IN
XGT
11
.
26
3.2.1
SYNTHESE
VON
CDNA
.
26
3.2.2
LIGATION
MIT
XGTL
1
-ARMEN
UND
IN
"VITRO"
VERPACKUNG
.
28
3.2.3
PLATTIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
XGTL
1-PHAGEN
.
29
3.2.3.1
KULTURMEDIEN
UND
ANTIBIOTIKA
.
29
3.2.3.2
INFEKTION
DER
PLATTIENMGSBAKTERIEN
.
31
3.3
IDENTIFIZIERUNG
VSG
CDNA
ENTHALTENDER
REKOMBINANTER
KLONE
.
31
M
3.3.1
IMMUNOBLOTNACHWEIS
DES
VSG-SS-GAL-FUSIONSPROTEIN
.
32
3.4
CHARAKTERISIERUNG
VSG
CDNA
ENTHALTENDER
KLONE
.
33
3.4.1
VSG
CDNA-ISOLIERUNG
.
33
3.4.1.1
ISOLIERUNG
GERINGER
MENGEN
VSG
CDNA
HALTIGER
X-DNA
.
33
3.4.1.2
ISOLIERUNG
GROESSERER
MENGEN
VSG
CDNA
HALTIGER
X-DNA
.
34
3.4.2
GROESSENANALYSE
DER
VSG
CDNAS
.
35
3.4.3
ISOLIERUNG
DER
CDNA
AUS
AGAROSE-GELEN
.
37
3.5
UMKLONIERUNG
VON
VSG
CDNA
IN
DEN
BAKTERIOPHAGEN
M13
.
38
3.5.1
ISOLIERUNG
VON
M13
RF-FORM
.
38
3.5.2
ECO
RI-VERDAUUNG
DER
RF-DNA
.
40
3.5.3
LIGATION
DER
VSG
CDNA
MIT
M13
RF-FONN
.
40
3.5.4
PRAEPARATION
KOMPETENTER
JM
103
ZELLEN
.
40
3.5.5
TRANSFORMATION
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
41
3.5.6
AMPLIFIKATION
VSG
CDNA
ENTHALTENDEN
REKOMBINANTEN
M13-KLONE
.
41
3.6
DNA-SEQUENZIERUNG
.
42
3.6.1
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTER
RF-DNA
.
42
3.6.2
ISOLIERUNG
EINZELSTRAENGIGERM13-DNA
.
43
3.6.3
HYBRIDISIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
M13-DNAS
.
44
3.6.4
VSG
CDNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
DIDEOXYKETTENTERMINATIONS
METHODE
(SANGER
ET
AL.
1977)
.
44
3.6.5
SEQUENZGELE
.
45
3.6.5.1
PRAEPARATION
DER
GELLOESUNGEN
.
45
3.6.5.2
BEHANDLUNG
DER
GLASPLATTEN
.
45
3.6.5.3
GELLAUF
UND
BEHANDLUNG
DES
GELS
NACH
DEM
LAUF
.
46
3.7
SOUTHERN
BLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
DER
VSG
CDNA
MIT
[Y32P]-ATP
MARKIERTEM
DTJG
.
47
3.7.1
SOUTHERN
BLOT
.
.47
3.7.2
HYBRIDISIERUNG
DER
VSG
CDNA
MIT
[
Y-32P]
ATP
MARKIERTEM
DTIOE
.
48
3.8
SONSTIGE
METHODEN
.
50
3.8.1
ETHANOL-FAELLUNG
.
50
3.8.2
PRAEPARATION
VON
PHENOL
.
50
3.8.3
PHENOL/CHLOROFORM
.
50
3.8.4
PHENOLEXTRAKTION
.
50
4
ERGEBNISSE
.
52
4.1
GEWINNUNG
DER
GESAMT-MRNA
.
52
4.1.1
"IN
VITRO"-TRANSLATION
DER
GESAMT-MRNA
.
53
4.2
SYNTHESE
VON
CDNA
AUS
GESAMT-MRNA
.
57
4.3
ERSTELLUNG
EINER
IGTL
1
CDNA-BIBLIOTHEK
.
58
4.3.1
LIGATION
DER
CDNA
MIT
A.
GTL
1-DNA
UND
"IN
VITRO"-VERPACKUNG
.
59
4.4
IDENTIFIZIERUNG
VSG
CDNA
HALTIGER
X-KLONE
.
61
4.4.1
GROEFIENANALYSE
DER
VSG
CDNA
.
64
4.5
SEQUENZIERUNG
AUSGEWAEHLTER
CDNAS
.
66
4.5.1
UMKLONIERUNG
VON
VSG
CDNA
IN
M13
.
67
4.5.2
DIE
SEQUENZIER-REAKTION
.
69
4.5.3
DIE
5'
UND
3'-ENDEN
DER
MONIERTEN
VSG
CDNA
.
71
4.5.4
DIE
VSG
CDNA-TOTALSEQUENZ
.
74
4.5.5
HINWEIS
AUF
BASENAUSTAUSCHPROZESSE
.
78
5
DISKUSSION
.
79
5.1
PROBLEME
DER
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
79
5.1.2
"FEHT-KLONIERUNG
VON
E.
COLI
DNA
.
80
5.1.3
DELETIONEN
IN
M13-DNAS
WAEHREND
DER
AMPLIFIKATION
.
83
5.1.4
BASENAUSTAUSCHPROZESSE
.
85
5.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
BENAT
1.3
VSG
MRNA
.
86
5.3
VERGLEICH
DER
BENAT
1.3
VSG-SEQUENZ
MIT
DEN
ANDEREN
VSGS
.
89
5.3.1
SEQUENZHOMOLOGIEN.
.
89
5.3.2
KONSERVIERTE
AMINOSAEUREMOTIVE
.
92
5.3.2.1
KONSERVIERTES
PROLIN-POSITIONSMOTIV
.
92
5.3.2.2
KONSERVIERTE
CYSTEINMOTIVE
.
93
5.3.3
POTENTIELLE
N-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN
.
99
5.3.4
SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGEN
.
100
5.3.5
REPETITIVE
HEPTADEN
.102
5.3.6
FAZIT
DER
VSG-SEQUENZVERGLEICHE
.105
6
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
.
106/108
7
SCHRIFTTUM
.
109 |
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